Anticorps spécifiques à l’immunoglobuline A dans le lait maternel et retard de la colonisation par Helicobacter pylori chez les nourrissons gambiens

L’immunoglobuline A IgA dans le lait maternel peut protéger les nourrissons gambiens contre la colonisation précoce par Helicobacter pylori Cette étude a recherché des preuves que cette protection pourrait être due à des anticorps IgA spécifiques. Méthodes: Soixante-cinq nourrissons ont été testés à partir de semaines. Lent maternel ont été mesurés pour déterminer la teneur totale en IgA et pour détecter des anticorps IgA spécifiques contre les préparations d’antigène H pylori à cellules entières et recombinantes.Résultats Dix enfants% n’avaient aucune preuve de colonisation H pylori précoce,% avaient une colonisation H pylori précoce et% avaient mélangé Résultats Les taux d’immunoglobulines G spécifiques circulantes maternelles, d’IgA totales du lait et d’IgA dirigées contre la préparation d’antigène H pylori à cellules entières n’étaient pas significativement associés au taux de colonisation H pylori infantile. des niveaux plus élevés d’anticorps IgA anti-uréase recombinants dans le lait a contrôlé les mères, en particulier au, et semaines post-partum P & lt; Conclusions Ces observations confortent l’hypothèse selon laquelle les anticorps dirigés contre l’uréase H pylori dans le lait maternel peuvent protéger contre la colonisation de l’enfance humaine

L’infection chronique par Helicobacter pylori est la cause la plus fréquente de maladie gastro-intestinale chez l’homme La colonisation commence souvent dans l’enfance, particulièrement dans les pays en développement , comme la Gambie Chez l’homme, aucune réponse immunitaire Cependant, l’allaitement peut protéger les nourrissons contre la colonisation précoce par H pylori , bien que des données contradictoires aient été produites à partir d’études transversales Nous avons précédemment rapporté une association entre la colonisation retardée H pylori et des taux élevés d’anticorps IgA anti-H pylori dans le lait maternel dans un pays où l’allaitement prolongé des nourrissons est normal Les données de ce rapport précédent suggèrent que des anticorps IgA spécifiques dans le lait jouent un rôle protecteur. contre la colonisation du nourrisson, n’a pas pris en compte l’effet protecteur possible des taux d’IgA totaux dans le lait maternel et n’a pas non plus Cette étude a donc été entreprise pour déterminer si la protection contre la colonisation du nourrisson H pylori attribuable au lait maternel était conférée par un effet spécifique ou était secondaire à une sécrétion élevée d’IgA totale chez des mères individuelles et à des identifier les cibles antigéniques possibles des anticorps du lait potentiellement protecteurs

Méthodes

Les enfants ayant des résultats séquentiels positifs au test respiratoire à ces âges ont été classés comme présentant une preuve de colonisation précoce par H pylori, et les autres enfants ont été classés comme présentant des résultats mitigés. IgA ELISA au lait3 Trois immunodosages distincts ont été réalisés avec du lait des niveaux d’IgA spécifiques dirigés contre la préparation d’antigène H pylori à cellules entières et des taux d’IgA spécifiques dirigés contre une préparation recombinante d’antigène d’urée pylori H Les taux d’IgA totaux dans les échantillons de lait ont été mesurés comme décrit ailleurs Pour immunoessais spécifiques, un antigène H pylori à cellules entières brut a été préparé à partir d’un pool de souches de H pylori isolées à partir de biopsies gastriques obtenues à partir d’adultes gambiens. En bref, des souches ont été cultivées sur gélose Thayer-Martin en gélose; Merck pour h dans une atmosphère microaérobie et ont été récoltés dans une solution saline tamponnée au phosphate. Les cellules ont été lysées par sonication, et les débris ont été retirés par centrifugation à g pendant min Le surnageant a été récupéré et utilisé comme antigène à une concentration finale en protéines solubles de ng / mL. Un immunodosage a été réalisé en utilisant une uréase recombinante. Préparer une préparation d’antigène à une concentration de protéine soluble finale de ng / ml. Uréase recombinante a été exprimée chez Escherichia coli et a été purifiée comme décrit ailleurs Elle contenait les deux sous-unités d’uréase Les échantillons de lait ont été congelés en h après la collecte, stockés à – ° C, et ont été transportés, congelés, au Royaume-Uni pour analyse. Avant d’effectuer le test, la phase aqueuse a été séparée des débris cellulaires et la couche graisseuse Pour les immunodosages IgA spécifiques, cette phase aqueuse a été ensuite absorbée à ° C pendant une nuit, aga Des échantillons de lait absorbé ont été utilisés dans les essais à une concentration finale de: IgA de lait lié a été identifié en utilisant la chaîne α anti-IgA conjuguée à la peroxydase spécifique de la chaîne α de l’anticorps monoclonal; Sigma, avec de l’ortho-phénylène diamine comme indicateur Chaque plaque de dosage contenait des échantillons de lait de contrôle choisis pour couvrir la plage utile du test, un contrôle réactif et des contrôles supplémentaires d’ascite de souris – un de souris immunisées contre la souris et l’autre une souche mutante de H pylori mutante ne sécrétant pas d’uréase Les anticorps murins liés de ces témoins ont été identifiés avec l’immunoglobuline anti-souris conjuguée à la peroxydase Sigma suivie de l’ajout du substrat et de l’indicateur. et les contrôles réactifs étaient acceptables, les résultats étaient initialement exprimés en rapports de densité optique, corrigés par référence aux valeurs moyennes obtenues par dosage préalable des échantillons de lait témoin. Les rapports de densité optique ont été convertis en concentrations relatives au moyen de courbes d’étalonnage. une concentration proportionnelle d’IgA spécifique en corrigeant la concentration totale d’IgA ncentration mesurée dans chaque échantillon de lait Les concentrations relatives n’étant pas quantifiées, la contribution précise de l’IgA spécifique de H pylori à l’IgA totale du lait n’a pas été déterminée, mais de simples titrages jusqu’au point final suggèrent que les anticorps spécifiques de H pylori comprennent La réactivité IgA totale dans un échantillon individuel Le dosage des IgG sériques spécifiques chez la mère a été réalisé par ELISA comme décrit ailleurs , avec utilisation des préparations antigéniques spécifiques séparément. Échantillons immunologiques occidentaux Les échantillons de lait obtenus chez les mères sélectionnées selon les résultats ELISA ont été effacés. préparations d’antigènes de cellules entières et préparation d’antigène entier à partir d’une souche mutante de délétion de U pylori non productrice d’uréase Des gels SDS-PAGE et des bandes de nitrocellulose ont été préparés comme décrit ailleurs Des bandelettes ont été incubées avec du lait d’essai échantillons dilués: dans du Tris-HCl avec% de protéines de lait bovin L’anticorps IgA de lait lié a été détecté en utilisant du phospha IgA de chèvre anti-IgA humaine conjuguée à de la tase, suivie d’un substrat de bromo-chloro-indoyl-phosphate avec du nitrobleu tétrazolium Les bandes séchées ont ensuite été scannées à l’aide d’un scanner à lit plat et les données ont été étalonnées en fonction des poids moléculaires. Band LeaderTM Technowledge et Excel Progiciels MicrosoftStatistiques Plus de% des échantillons de lait possibles ont été recueillis auprès des mères à environ,,,, et semaines après l’accouchement et analysés Un ensemble de données moins complet a été obtenu à partir d’échantillons recueillis et analysés à d’autres moments. Diverses raisons logistiques L’analyse et la présentation des résultats ont été limitées aux échantillons obtenus aux,,,, et semaines après l’accouchement. Comparaison des taux d’anticorps maternels pendant toute la lactation selon les résultats des tests respiratoires de l’enfant avec le test t non apparié de Student.

Résultats

Soixante-quatre des mères étaient séropositives pour les IgG, comme l’a révélé l’analyse de la densité optique médiane des préparations d’antigène H pylori à cellules entières; intervalle interquartile, – Les mères ont également exprimé des réactivités IgG contre la croissance, avec des densités optiques allant de la densité optique médiane,; intervalle interquartile, – Il n’y avait pas de corrélation entre le niveau de réponse IgG sérique détectée contre les préparations de cellules entières et de préparations antigéniques chez les mères individuelles. Dix enfants avaient des résultats de tests respiratoires négatifs séquentiels jusqu’à des mois et ont été classés comme Colonisation de pylori Quatre de ces enfants avaient un seul point de données manquant et pouvaient donc avoir été mal classés. Dix enfants% avaient des résultats séquentiels positifs à l’âge et étaient classés comme ayant une colonisation précoce de pylori. Quarante-trois enfants avaient une respiration positive et négative Deux enfants avaient ⩾ des données manquantes et n’ont donc pas été inclus dans l’analyse. Il n’y avait pas de différences significatives dans les taux de densité optique des IgG sériques maternelles par rapport à l’antigène H pylori. préparations entre les mères d’enfants sans colon H pylori précoce le taux moyen d’antigène cellulaire entier; % IC, -, les mères d’enfants avec la colonisation H pylori précoce signifient le rapport antigène entier cellule,; % IC, -, et les mères d’enfants avec des résultats de test mixtes signifient le ratio antigène-cellule entier,; % CI, – Les concentrations moyennes d’IgA totales dans les échantillons de lait obtenus semaines après l’accouchement étaient mg ​​/ mL% CI, – parmi les mères d’enfants sans colonisation précoce H pylori et ne différaient pas significativement des concentrations chez les mères d’enfants avec H colonisation précoce. mg / ml % IC, – ou parmi les mères d’enfants avec des résultats de test mixtes signifie la concentration, mg / mL; % IC, – Les concentrations d’IgA totales dans le lait diminuent progressivement tout au long de la lactation , mais aucune différence significative n’a pu être décelée entre les mères d’enfants ou les mères d’enfants sans colonisation précoce à n’importe quel stade de l’étude. dirigé contre les préparations d’antigène de cellules entières brutes tout au long de la lactation était également similaire pour les mères d’enfants avec la concentration proportionnelle moyenne de colonisation H pylori précoce,; % CI, -, par rapport aux mères d’enfants avec la colonisation précoce H pylori signifie concentration proportionnelle,; % IC, – et les mères d’enfants avec des résultats d’analyse mixtes signifie la concentration proportionnelle,; Toutefois, les mères d’enfants qui ne présentaient pas de signe de colonisation précoce par H pylori ont produit des concentrations proportionnellement plus élevées d’IgA anti-inflammatoires dans leur lait que les autres mères pendant les premiers mois de l’analyse de la variance, P & lt; Inversement, en semaines, les concentrations proportionnelles d’IgA anti-inflammatoires étaient les plus élevées chez les mères d’enfants ayant des résultats positifs aux tests respiratoires précoces et chez les mères d’enfants ayant des résultats négatifs. par les données transversales montrées dans la figure, qui démontrent que les taux d’IgA anti-uréase ont commencé à augmenter mais ont diminué tout au long de la lactation chez les mères d’enfants non colonisés mais sont devenus faibles chez les mères d’enfants ayant développé la colonisation H pylori. atteindre la signification dans cette population

Figure View largeTélécharger DiapositiveAnti-recombinante uréase rUrease IgA concentrations proportionnelles dans le lait pendant la première année de lactation pour les mères d’enfants ayant des résultats séquentiels de test d’haleine négative à l’âge de tous les groupes négatifs, par rapport aux mères d’enfants ayant des résultats séquentiels positifs. groupe positif et mères d’enfants ayant des résultats mixtes de test d’haleine groupe à résultats mitigés Bars,% CIsFigure Vue largeTélécharger slideOurease anti-recombinante rUrease Concentrations proportionnelles d’IgA dans le lait pendant la première année de lactation pour les mères d’enfants ayant des résultats séquentiels d’urée négative pour les mois d’âge groupe négatif, comparé aux mères d’enfants ayant des résultats séquentiels d’analyse d’urée positive séquentielle groupe positif et mères d’enfants ayant des résultats mitigés aux tests d’haleine groupe de résultats mitigés Bars,% IC

Figure View largeTélécharger DiapositiveAnti-recombinante uréase Augmenter les concentrations proportionnelles d’IgA dans le lait pour les mères pendant la première année de lactation, selon que leurs enfants ont eu un résultat positif au test d’haleine urée ou n’ont pas eu de résultat positif à l’analyse d’haleine. groupe non-colonisé à l’âge spécifié Bars,% CIsFigure View largeTélécharger slideAnti-recombinante uréase augmenter les concentrations proportionnelles d’IgA dans le lait pour les mères pendant la première année de lactation, selon que leurs enfants ont eu un résultat positif au test respiratoire à l’urée Les barres,% CIsWestern blot, utilisant des préparations d’antigènes de cellules entières et de protéines brutes, ont confirmé la reconnaissance des principales sous unités d’uréase par IgA dans le lait des mères des nourrissons n’a montré aucune preuve de la colonisation précoce de H pylori Un résultat typique de Western blot est sho La seule bande protéique reconnue dans la préparation était la sous-unité kDa Une bande de kDa était également détectable uniquement sur des immunoblots en utilisant la préparation d’antigène de cellule entière brute Des bandes supplémentaires d’anticorps IgA du lait reconnaissant d’autres antigènes H pylori étaient plus clairement visualisées sur des immunoblots qui utilisaient une préparation antigénique dérivée de la souche mutante de délétion uréase négative de H pylori par rapport à ceux qui utilisaient la préparation antigénique de cellules entières brute utilisée dans le test ELISA

Figure Vue grandDownload slide Western blot d’IgA dans un échantillon de lait obtenu de la mère dans une voie de préparation d’antigène de cellules entières, préparation d’antigène dérivé d’une souche mutante de Helicobacter pylori uréase-négative avec une protéine -ng dans la voie et un -ng protéine dans la voie, et la préparation de l’antigène uréique recombinant avec une protéine -ng dans la voie et une protéine -ng dans la voie Les marqueurs de poids moléculaire sont montrés à gaucheFigure View largeDownload slideOblot Western d’IgA dans un échantillon de lait obtenu de la mère dans une cellule entière brute voie de préparation d’antigène, préparation d’antigène dérivée d’une souche d’Helicobacter pylori mutant à délétion urée négative avec une protéine -ng dans la voie et une protéine -ng dans la voie, et préparation d’antigène d’uréase recombinante avec une protéine -ng dans la voie et un protéine dans la voie Les marqueurs de poids moléculaire sont montrés à gauche

Discussion

y résultats négatifs chez de nombreux enfants Ceci a été observé en Gambie et ailleurs et suggère que la colonisation initiale de H pylori dans l’enfance humaine peut être transitoire, comme c’est le cas chez certains modèles de primates . Les chercheurs estiment que le test d’urée peut être excessivement sensible et donc relativement non spécifique chez les très jeunes enfants Nous avons surmonté ce problème en utilisant des résultats de tests négatifs séquentiels pour identifier les enfants sans preuve de la colonisation précoce de H pylori. anticorps IgG spécifiques contre les antigènes H pylori sont lents à apparaître au cours de la colonisation naturelle dans l’enfance humaine La plupart anti-IgG pylori systémique chez les enfants âgés de & lt; mois les anticorps IgG contribuent à l’immunité contre l’infection gastrique avec les espèces Helicobacter dans certains modèles murins , ce qui soulève la possibilité que les IgG maternelles spécifiques confèrent une protection passive contre H pylori dans l’enfance Cependant, nous n’avons pu déceler aucune association entre les taux d’anticorps IgG spécifiques circulants maternels et les résultats des tests d’haleine urée chez les nourrissons. Aucune différence entre les taux d’IgA totales dans le lait et les IgA spécifiques dirigées contre le pylori H pylori brut. Ceci contraste avec les données de notre étude préliminaire, dans laquelle nous avons utilisé un antigène préparé par élution de protéines H pylori solubles et rapporté un effet protecteur de la mère maternelle. anticorps du lait contre un antigène H pylori à cellules entières Il est probable que l’antigène éluat utilisé dans cette étude contenait proportionnellement plus d’enzyme uréase et d’antigène contenant des débris bactériens que la préparation d’antigène brut soniquée et centrifugée utilisée dans la présente série. Le lait humain contient une gamme de substances pouvant protéger les nourrissons Le lait humain inhibe également la liaison de H pylori aux surfaces des cellules épithéliales d’une manière indépendante des anticorps , un effet qui a également été observé dans les échantillons de lait de mères gambiennes. La protection contre la colonisation conférée par le lait maternel n’est pas absolue, puisque% des nourrissons allaités dans cette étude ont eu un résultat positif au test respiratoire, malgré l’ingestion de grandes quantités de lait et d’anticorps IgA totaux. des mères d’enfants sans preuve de la colonisation précoce H pylori peut être plus efficace pour inhiber H pylori tha Notre conclusion la plus excitante est l’association entre la colonisation retardée de H pylori par le nourrisson et les taux élevés d’anticorps IgA spécifiques dirigés contre l’augmentation du lait maternel. Les mères d’enfants sans signe de colonisation précoce par H pylori montrent des taux significativement plus élevés d’anti- Réduire les anticorps IgA dans le lait, comparé aux autres mères, à, et semaines après l’accouchement Ceci suggère que les niveaux d’anticorps spécifiques dans le lait maternel influencent la colonisation ultérieure du nourrisson. Des preuves montrent que des anticorps similaires peuvent conduire à l’immunité dans des modèles animaux d’infection à H. pylori. Plusieurs groupes de recherche ont réussi à immuniser par voie orale des souris contre des infections à Helicobacter avec des préparations d’uréase , et certains ont réussi le même modèle avec d’autres antigènes Cette immunisation thérapeutique peut être indépendante des anticorps . in et Blanchard et al ont montré qu’un anticorps monoclonal IgA contre la facilité peut empêcher la capacité d’Helicobacter felis à infecter les souris.D’après l’âge, des diminutions graduelles des taux d’anticorps spécifiques dans le lait ont été observées chez les mères d’enfants non-colonisés et une augmentation des taux d’anticorps spécifiques chez les mères. Il est possible que cette augmentation des taux d’anticorps spécifiques ait été causée par une exposition accrue des mères amorcées à l’antigène secondaire à la colonisation de leurs nourrissons. En Gambie, des anticorps spécifiques dans le lait dirigés contre des facteurs de colonisation bactériens connus comme l’uréase La colonisation par H pylori chez les nourrissons Si cela confère un avantage aux enfants reste à établir Les principales implications de notre travail Premièrement, l’identification des anticorps IgA humains naturels qui fournissent une protection passive contre la colonisation H pylori soutient l’idée qu’une immunité active contre H la colonisation pylori pourrait être réalisée avec l’utilisation de v Accines qui stimulent la production de la même classe d’anticorps Deuxièmement, parce que la colonisation par H pylori se produit tôt en Gambie, les stratégies d’intervention de vaccination, si elles sont envisagées, devront être appliquées peu de temps après la naissance.

Remerciements

Nous remercions les habitants de Keneba, Gambie, pour leur aide et leur coopération dans cette étude et à Mme J Piper pour son travail de laboratoire. Soutien financier La subvention du Thrasher Research Fund -, au JET et au Medical Research Council de Grande-Bretagne JEGB, MH, WAC et LTWConflict d’intérêt HK et TPM sont employés par Acambis, une société de biotechnologie qui s’intéresse au développement de vaccins H pylori JET, JEGB, MH, WAC et LTW: aucun conflit