Commentaire “ Les progrès récents des rythmes circadiens dans le système cardiovasculaire

lire avec intérêt la récente publication de Chen et Yang (Chen et Yang, 2015). Dans cette revue d’excellente qualité, les auteurs détaillent notre compréhension actuelle des liens entre les rythmes circadiens et le système cardiovasculaire. Néanmoins, plusieurs aspects importants de nombreuses découvertes clés récentes ont été négligés dans la section “ Rythmes circadiens et infarctus du myocarde. &#X0201d En fait, les auteurs se concentrent sur le taux plus élevé documenté d’infarctus du myocarde survenant dans le matin et sur la variation circadienne des fonctions cardiaques liées au remodelage cardiaque. De notre point de vue, ils ne discutent pas de diverses publications récentes importantes basées sur des données solides soutenant un lien entre les rythmes circadiens et la taille de l’infarctus du myocarde et la mort par infarctus du myocarde.En effet, différentes études cliniques ont récemment rapporté des variations circadiennes du fardeau ischémique chez les patients ST-infarctus du myocarde (STEMI). Dans Reiter et al. (2012) et notre équipe (Fournier et al., 2012) ont observé une activité crête de la créatine kinase (CK) plus élevée (comme indicateur de la taille de l’infarctus du myocarde) chez les patients présentant un début de symptômes entre 00:00 et 05:59. En conséquence, ces données indiquent un décalage entre l’heure d’occurrence maximale (en seconde partie de matinée) et la durée de sévérité maximale. En 2013, des différences en termes de vulnérabilité du cardiomyocyte à l’ischémie ont été étudiées chez 1021 patients subissant une intervention coronarienne percutanée élective (PCI) entre 2007 et 2011 (Fournier et al., 2014). Les patients ont été divisés en deux groupes en fonction de l’heure de début du PCI: le groupe du matin (n = 651) entre 07h00 et 11h59, et le groupe de l’après-midi (n = 370) entre 12h00 et 18h59. Le taux d’infarctus du myocarde periprocedural était statistiquement plus bas dans le groupe du matin comparé au groupe d’après-midi (20% contre 30%, p < 0.001). Cette différence est restée statistiquement significative après appariement des scores de propension (21% vs 29%, p = 0,03). Enfin, en 2014 et 2015, deux études importantes de Mahmoud et al. (2014) et par notre équipe (Fournier et al., 2015) ont confirmé les premiers résultats basés sur des patients STEMI. À partir d'un registre multicentrique de 6799 patients STEMI consécutifs subissant une ICP primaire entre 2004 et 2010, Mahmoud et al. ont observé que la taille de l'infarctus présentait une variation circadienne avec la plus grande taille de l'infarctus chez les patients avec un début de symptômes vers 3 heures du matin (pic CK 1322 U / l, intervalle de confiance à 95%: 1217) et plus petit : 00 le matin (pic estimé CK 1071 U / l, IC 95%: 1001 – 1146, réduction relative 19%, p = 0,001).Dans nos données sur 6223 patients STEMI admis dans 82 hôpitaux de soins de courte durée en Suisse et traités avec PCI dans les 6 heures suivant l'apparition des symptômes, seule une harmonique de 24 heures était significativement associée au pic CK (p = 0,0001). La valeur maximale maximale de la CK (2315 U / L) était chez les patients présentant un début de symptômes à 23:00, alors que la moyenne minimale (2017 U / L) était de 11:00. Dans ces études, la relation entre la taille de l'infarctus du myocarde et l'heure d'apparition des symptômes était indépendante du temps ischémique (délai entre l'apparition des symptômes et la revascularisation) ou la prise en charge de l'infarctus du myocarde. mortalité au cours de leur hospitalisation ou même au suivi. Dans notre première publication (Fournier et al., 2012) basée sur 353 patients consécutifs avec STEMI traités par PCI, la mortalité à 30 jours pour les patients STEMI avec apparition des symptômes entre 00:00 et 05:59 était significativement plus élevée que dans tout autre temps groupe (p < 0,05). Dans notre deuxième étude basée sur les 6223 patients, 23 patients (3,58%) sont décédés pendant leur hospitalisation et seule l'harmonique de 24 h était significativement associée à la mortalité hospitalière. Le risque de décès par STEMI était plus élevé chez les patients présentant un début de symptômes à 00h00 et plus faible chez ceux présentant un début à 12h00. Ainsi, la preuve d'une plus grande vulnérabilité du cœur à l'ischémie lorsqu'un infarctus du myocarde survient la nuit est maintenant et basé sur un grand nombre d'études. Ces données confirment des observations récentes basées sur des modèles animaux où l'horloge circadienne des cardiomyocytes affectait les réponses cardiaques à divers stresseurs, y compris l'ischémie / reperfusion, en modulant plusieurs voies de signalisation cardioprotectrices (Durgan et Young, 2010; Durgan et al., 2010). En effet, dans l'étude de Durgan et al. (2010), les infarctus du myocarde survenant pendant la période de transition sommeil-veille étaient 3,5 fois plus importants que ceux se produisant entre les deux temps, mais la suppression du gène de l'horloge abolissait ces différences, prouvant ainsi le rôle central de la machinerie moléculaire circadienne. Synthèse concise des abyssinones et découverte de nouveaux inhibiteurs du cancer de la prostate et de l'expression de la MMP-2 Les abyssinones sont une famille de flavanones chiraux énantiomériquement enrichis qui présentent une gamme variée d'activités biologiques prometteuses (voir Figure ​ .1 − 3 Bien que les extraits contenant ces petites molécules aient été utilisés comme remèdes traditionnels, toute étude de leurs propriétés anticancéreuses spécifiques nécessite une approche synthétique générale qui peut y accéder sous une forme énantiomériquement enrichie. Notre programme orienté vers la synthèse de produits naturels contenant du pyrane a suscité notre intérêt pour ces composés.4,5 En dépit de leur promesse thérapeutique, les abyssinones n'ont pas été (a) synthétisés avec un contrôle sur la stéréochimie absolue et (b) évalués pour leur capacité La structure sans fioritures de flavanones dément le défi d'exécuter une stratégie qui installe et maintient la configuration en position C2.9 Ce stéréocentre dans les abyssinones est très sensible et les conditions légèrement basiques favorisent la réversibilité du cancer. ouverture de cycle à achiral 2 ′ -hydroxychalcones.10 En outre, les flavanones contenant des substituants donneurs d'électrons dans le C4 ′ La position est particulièrement sensible à la racémisation.9,11 Un nombre limité d'approches pour la synthèse stéréosélective des flavanones ont été développées, mais ces approches ne sont pas générales et ne fourniraient pas le noyau de l'abyssinone de manière concise.12 − 16Figure 1Retrosynthetic analysis des produits naturels abyssinone.Notre plan synthétique est décrit dans la figure ​ Figure1.1. L'étape clé de la stratégie est l'application de notre cyclisation asymétrique catalysée par la thiourée, qui peut fournir un accès contrôlé à l'un ou l'autre stéréoisomère de ces produits naturels.9,11 Une condensation de Knoevenagel entre un ester β -céto protégé et différents aldéhydes correspondant à chaque abyssinone fournirait les alkylidènes requis pour notre cyclisation catalysée par la thiourée. Notre plus grande préoccupation était de maintenir l'intégrité du nouveau stéréocentre C2, qui dépendrait fortement de l'identification de conditions de décarboxylation / déprotection douces. Nous prévoyions que nous pourrions maximiser l'efficacité si la décarboxylation et le démasquage du phénol C7 étaient effectués dans une seule fiole comme dernière étape de la synthèse. Le premier défi rencontré dans la synthèse totale des abyssinones impliqués dans l'accès aux substrats alkylidène pour la cyclisation de la thiourée (voir figure ​ figure22 pour un exemple représentatif avec abyssinone I). En utilisant l'aldéhyde requis 5, préparé à partir de 4-hydroxybenzaldéhyde, 17 on a tenté la condensation avec l'ester 7-protecteur 7 protégé dans des conditions standard de Knoevenagel (acétate de pipéridinium, appareil Dean).Ces réactions ont produit l'alkylidène E désiré dans 95: 5 E: Z pour tous les aldéhydes utilisés dans la condensation de Knoevenagel. (Nous n'avons pas pu générer et isoler en quantité les espèces Z alkylidène avec lesquelles effectuer des études de cyclisation.) Malheureusement, les conditions de la réaction ont également conduit à la formation de quantités significatives d'adduits de cyclisation racémiques (± 9). Après avoir étudié différentes conditions, nous avons découvert que bis-morpholine aminal 6, utilisé directement sans purification, a subi une condensation de Knoevenagel lisse avec β -ketoester 7 (2 équiv de l'acide acétique glacial à 22 ° C dans le toluène) à délivrer l'alkylidène 8 avec des taux minimaux de composés cyclisés cycliques. Comme prévu, l'alkylidène 8 résultant subit l'addition de conjugué intramoléculaire souhaitée lorsqu'il est exposé à 10% en moles de C6 dérivé de la quinine. catalyseur de thiourée I.18 Des itérations multiples de la cyclisation de l'alkylidène 8 ont donné de façon constante de la carboxyflavanone 9 avec un bon rendement (78 ° C) et une excellente énantiosélectivité (90 ° C, 91% ee). Fait important, les précurseurs d'alkylidène ont subi une cyclisation lisse avec un excellent contrôle sur le stéréocentre C2 nouvellement formé en utilisant nos conditions de catalyse de la thiourée chirale.Finalement, la décarboxylation et la déprotection de 9 ont été accomplies dans un seul flacon en utilisant MgBr2 · OEt2, mais les faibles rendements pour cette séquence réactionnelle (moins de 25%) nous ont conduit à étudier des conditions de réaction à plus haut rendement. Malheureusement, diverses t-butyl carboxyflavanones protégées par O-aryle n'ont pas pu être converties en 1 &numsp &numsp &numsp sans une épimérisation significative ou une fonctionnalisation des abyssinones contenant des chaînes latérales prényls. Nous prévoyions que l'échange de l'ester t-butylique contre un ester allylique et le remplacement du groupe méthoxyméthyle par un groupe allylique pourraient permettre une décarboxylation / déprotection légère à simple ballon en utilisant la catalyse au palladium19. Les alkylidènes à protection allylique 10 et 13 étaient nécessaires. synthétisé directement à partir des aldéhydes correspondants en utilisant notre approche bis-aminale douce. Les principales cyclisations asymétriques de 10 ° ont été catalysées par l'exposition à 10% en moles de la thiourée I ou II dérivée de la quinine ou de la quinidine (20) à 25 ° C dans le toluène (tableau 1). ). L'utilisation de morpholine en présence de 5% en moles de Pd (PPh3) 4 a favorisé la déprotection et la décarboxylation à 22 ° C pour donner le produit naturel abyssinones I, II, III et IV. et les rendements élevés.21 Les niveaux d'énantio-enrichissement pour chaque composé de l'addition conjuguée asymétrique (c'est-à-dire 10 − 13 à 14 Ȣ 17) étaient excellents. Le catalyseur II de la thiourée dérivé de la quinidine fournit à chacune des abyssinones (après déprotection / décarboxylation) la configuration naturelle en C2, tandis que l'utilisation de la thiourée pseudoantiomère I génère les (R) -abyssinones non naturelles avec des niveaux comparables de stéréosélectivité. Ces résultats sont particulièrement satisfaisants puisque (1) les flavanones contenant des substituants alcoxy ou hydroxy dans le C4 ′ la position est sensible à l'épimérisation due à la formation de cations benzyliques stabilisés et (2) les flavanones peuvent subir une ouverture de cycle réversible pour former des 2-hydroxy-2-clones lors d'une exposition à des bases douces. Les rendements globaux pour ce procédé (addition conjuguée, déprotection allylique et décarboxylation) ont fourni une méthode efficace pour la construction de ces flavanones et ont permis l'évaluation de notre méthode de synthèse en termes d'efforts synthétiques plus complexes.Tableau 1 Synthèse Asymétrique Catalytique des Abyssinones On a cherché à déterminer si les abyssinones énantiomériquement enrichies et leurs énantiomères correspondants induiraient une activité biologique importante et stéréodépendante. Les membres de la grande famille des flavonoïdes (plus de 5000 produits naturels) ont présenté une grande variété d'effets anticancéreux, agissant comme antioxydants, inhibiteurs de l'angiogenèse et agents cytotoxiques puissants.22 De plus, plusieurs flavonoïdes inhibent l'activité et régulent négativement l'expression des enzymes pro-métastatiques, telles que les métalloprotéinases matricielles (MMPs), dans une variété de lignées de cellules tumorales. 23 − 26 Cependant, ces études se sont concentrées principalement sur les isoflavones achirales, et aucune de ces études n'a été menée à ce jour sur la famille abyssinone de produits naturels flavanone.Nos études se sont concentrées sur le cancer de la prostate (PCa), qui est la deuxième cause la plus fréquente de décès liés au cancer chez les hommes américains. La mortalité par PCa est principalement causée par le développement d'une maladie métastatique, dans laquelle les cellules PCa passent de la prostate à des sites distants du corps et poursuivent leur croissance incontrôlée27. Les protéases telles que les MMP augmentent l'invasion cellulaire et donc leur synthèse par le cancer. les cellules facilitent le mouvement et le comportement métastatique.28 La MMP-2 s'est révélée être une cible particulièrement importante pour le PCa humain, car son expression accrue dans les tissus laisse présager une métastase29. L'expression diminuée de MMP-2 entraîne également une diminution de l'invasion des cellules PCa humaines in vitro et une diminution des métastases du PCa humain. cellules dans un modèle murin de métastase.25,30 Par conséquent, les MMP, et MMP-2 en particulier, représentent une cible thérapeutique importante et largement étudiée. Cependant, bien que certains inhibiteurs de la première génération de MMP aient été efficaces dans les modèles précliniques, les essais cliniques ultérieurs ont eu peu de succès, principalement en raison d'une toxicité systémique grave31,32. Une autre stratégie prometteuse pour contrer l'effet pro-invasif de la MMP-2 Nous avons démontré que les cellules PCa traitées avec la génistéine d'isoflavones présentaient des niveaux diminués du transcrit du gène MMP-2 et de la protéine, ce qui conduit à une réduction globale de la quantité de cette enzyme produite par les cellules tumorales. En outre, des études réalisées sur d'autres lignées cellulaires cancéreuses ont démontré que l'inactivation des siRNA de la MMP-2 entraîne une réduction de l'invasion et de l'angiogenèse induite par les tumeurs.33 Le développement d'une méthode de régulation à la baisse des étant potentiellement moins toxique que les inhibiteurs de MMP traditionnels. Ainsi, nous avons cherché à évaluer la capacité des abyssinones générés dans notre laboratoire à inhiber la croissance des cellules PCa et à réguler à la baisse l'expression de MMP-2, puisque ces types d'interventions pouvaient à la fois atténuer / prévenir les métastases et augmenter les taux de survie. Nous voulions également évaluer l'effet de la stéréochimie sur la capacité des abyssinones à inhiber la prolifération cellulaire et à réguler à la baisse l'expression de MMP-2. Nos études ont commencé par évaluer l'impact des abyssinones énantio-enrichies et racémiques (I, II, III et IV 4 ′ -OMe) sur la croissance cellulaire PCa métastatique (PC3-M). Étant donné que les abyssinones énantio-enrichies n'ont jamais été synthétisées, nous avons particulièrement cherché à déterminer si les énantiomères de chaque composé présentaient une cytotoxicité différentielle comparativement au mélange racémique34. De plus, ces études de cytotoxicité ont été déterminantes pour définir les niveaux non toxiques de 1 − 4, qui a guidé les évaluations d'expression de transcription de MMP-2 (voir ci-dessous). Des cellules PC3-M humaines variant métastasiques ont été traitées pendant 3 jours avec du racémate M, (R) - ou (S) -1 − 4 (12 composés totaux) dans des conditions de croissance cellulaire exponentielle. Les valeurs de CC50 ont été déterminées pour chaque composé et sont représentées sur la figure ​ Comme indiqué par la figure ​ Figure3,3, (S) -abyssinones III (3) et IV 4 ′ -OMe (4) ont tous deux démontré des niveaux statistiquement significatifs d'inhibition de la prolifération des cellules PC3-M par rapport à la ( R) -énantiomères et les mélanges racémiques. En fait, les (S) -abyssinones III et IV 4 ′ -OMe ont causé une diminution d'environ 2 fois de la prolifération des cellules PC3-M, car elles possédaient des valeurs de CC50 de 17 et 12 μ M, respectivement , par rapport aux valeurs CC50 des énantiomères (R) et des racémates à 42 [(R) -3], 57 [(±) - 3], 46 [(R) -4], et 33 μ M [(±) - 4]. Ces résultats indiquent clairement le rôle clé de la stéréochimie dans l'activité biologique de ces composés et valident notre approche synthétique énantiosélective pour ces produits naturels particuliers. D'autres preuves de l'importance de la synthèse énantiosélective des abyssinones sont également fournies par les données d'inhibition de la croissance pour les composés racémiques (Figure 3) (Figure 3) .3). L'abyssinone racémique II était en réalité significativement moins actif que les deux composés énantio-enrichis. Ce résultat particulièrement intéressant indique qu'il peut y avoir un certain antagonisme fonctionnel entre les énantiomères de l'abyssinone II qui conduit à une réduction significative de l'activité dans le mélange racémique. Enfin, nous avons également effectué quelques expériences préliminaires pour essayer de déterminer si les abyssinones inhibaient la croissance cellulaire via un mécanisme cytotoxique (c'est-à-dire, la mort cellulaire) ou cytostatique (c'est-à-dire, l'arrêt du cycle cellulaire). Fait intéressant, lorsque les valeurs d'absorbance à 540 nm pour les cellules traitées à 50 μ M (t = 72 h) ont été comparées à celles pour les cellules non traitées au début de l'expérience (t = 0 h), (S) - abyssinones III et IV 4 ′ -OMe semblent tous deux réduire le nombre de cellules à un niveau égal ou inférieur à celui du début de l'expérience. Ce résultat suggérait que ces composés agissaient par un mécanisme cytotoxique, ce qui a été vérifié par l'imagerie cellulaire qui indiquait la mort cellulaire brute à 72 h (voir les Informations de Support).Cependant, tous les autres composés, y compris les (R) -abyssinones III et IV 4, ont démontré des valeurs d'absorbance supérieures à celle de la mesure t = 0, ce qui indique qu'ils agissaient très probablement par l'intermédiaire d'un cytostatique ou d'un cytostatique. combinaison (cytostatique et cytotoxique). Par conséquent, toutes ces découvertes combinées soulignent l'importance de notre approche de catalyse par liaison hydrogène, car cette information n'aurait pas pu être obtenue sans des quantités suffisantes de composés énantio-enrichis pour analyse.Figure 3CC50 pour chaque énantiomère et les mélanges racémiques d'abyssinones 1 − 4 contre la prolifération des cellules PC3-M. Pour les détails expérimentaux, voir l'information de soutien. Nous avons ensuite choisi d'évaluer l'impact de (R) - et (S) -1 − 4 (huit composés totaux) sur les niveaux de transcription MMP-2, étant donné que plusieurs membres de Il a été montré que la famille des flavonoïdes de produits naturels régulait négativement l'expression de cette importante enzyme pro-métastatique. Notre objectif était non seulement de déterminer la cytotoxicité de ces composés (leur potentiel chimiothérapeutique), mais aussi d'évaluer leur capacité à cibler la synthèse de MMP-2 et à agir comme agents chimiopréventifs capables de bloquer la progression vers un état pathologique plus agressif. Les cellules ont été traitées avec chaque composé à 3 ° C pendant 3 jours, car cette dose n'était pas associée à la cytotoxicité par le test MTT. Fait important, nous avons choisi cette dose non toxique pour notre analyse afin d'éliminer tous les effets non spécifiques confusionnels dus à la toxicité cellulaire. Après l'exposition à l'abyssinone, les niveaux de transcrits de MMP-2 ont été mesurés en isolant l'ARN et en effectuant une transcription inverse et des réactions quantitatives en chaîne par polymérase en temps réel (qRT-PCR). Les niveaux de transcrits de MMP-2 ont été mesurés à la place des niveaux de protéine MMP-2 car l'expression de MMP-2 est étroitement régulée au niveau transcriptionnel36 et parce que les flavonoïdes inhibent l'expression du transcript MMP-2. De plus, des niveaux réduits d'expression de l'ARNm de MMP-2 ont également été corrélés avec un stade pathologique inférieur de la PCa et, par extension, un résultat clinique amélioré29,37. La mesure des niveaux de transcription fournit une mesure directe de la capacité des abyssinones à les processus cellulaires cibles responsables de la régulation de cette enzyme pro-métastatique cliniquement pertinente. Une fois les niveaux de transcrits MMP-2 mesurés par qRT-PCR, ils ont été normalisés par rapport au gène de contrôle interne GAPDH (glycéraldéhyde-3-phosphate déshydrogénase), qui a été mesuré dans les cellules traitées et non traitées.38 La GAPDH est exprimée à des niveaux constants dans un large éventail de systèmes biologiques et est largement utilisé à des fins de contrôle. Nous avons constaté que les niveaux d'expression GAPDH étaient les mêmes pour les cellules traitées et non traitées, ce qui indique que les effets sur l'expression de MMP-2 ne sont pas le résultat de la régulation non spécifique de la transcription.Avec les études MMP-2 et la croissance cellulaire études, les énantiomères abyssinone ont montré une activité biologique différentielle statistiquement significative (Figure ​ (Figure4) .4). En particulier, à la fois pour les abyssinones III et IV 4, les énantiomères (R) ont supprimé l'expression de MMP-2 à 65% de cellules témoins non traitées, respectivement, à une concentration non toxique (3 &#x003bc M). De manière intéressante, l'activité contre l'expression de MMP-2 pour les énantiomères (R) non naturels était significativement supérieure à celle pour les énantiomères (S) naturels correspondants. Bien qu'il existe des exemples limités de produits naturels dont les énantiomères non naturels démontrent une activité biologique comparable (par exemple, la frédéricamycine A39), nous ne connaissons pas d'autres composés que l'ent-roseophilline40 et les (R) -abyssinones III et IV 4 -OMe qui sont plus actifs que leurs énantiomères naturels. Ces exemples démontrent clairement que la construction d'antipodes non naturels par synthèse stéréosélective ouvre de nouvelles voies pour un développement thérapeutique potentiel. Les essais in vitro décrits ci-dessus interrogent des fonctions biologiques nettement différentes et mettent en évidence l'importance d'une installation réussie des éléments stéréochimiques lors des synthèses des abyssinones. Les études de cytotoxicité et de MMP-2 réalisées avec chaque énantiomère montrent des profils de réponse différents à travers les abyssinones (1 − 4), avec des capacités prometteuses de cibler différentiellement la croissance cellulaire et le potentiel métastatique.Figure 4MMP-2 niveaux d'expression de PC3- abyssinone-traité M cellules à 3 μ M. Pour les détails expérimentaux, voir les informations de support.En résumé, les premières synthèses asymétriques des abyssinones I − III et IV 4 ′ -OMe ont été réalisées en utilisant une addition de conjugué intramoléculaire catalysée par la thiourée chirale. Une déprotection d'allyle en tandem / décarboxylation d'ester allylique génère les produits finaux dans un seul flacon tout en maintenant l'intégrité stéréochimique au centre C2.Notre voie de synthèse délivre les produits naturels et les antipodes correspondants avec d'excellents niveaux d'énantiosélectivité, facilitant ainsi l'évaluation des stéréoisomères individuels et alimentant la découverte de leur bioactivité différentielle. Les principales observations selon lesquelles les abyssinones réduisent spécifiquement et différentiellement la croissance cellulaire et suppriment l'expression de MMP-2 dans des cellules entières à des concentrations non toxiques soulignent l'utilité de notre synthèse catalytique asymétrique réussie de ces produits naturels. Ces expériences combinées intègrent pleinement la catalyse asymétrique, l'application de synthèse cible, et la découverte de biologie chimique avec pertinence médicinale. Des recherches continues sur les abyssinones et les composés apparentés pour comprendre leur activité biologique contre divers modèles de cancer sont en cours dans nos laboratoires.