CZ415, un inhibiteur mTOR hautement sélectif démontrant une efficacité in vivo dans un modèle d’arthrite induite par le collagène

La cible mammalienne de la rapamycine

(mTOR / FRAP1) est une sérine / thréonine protéine kinase, qui appartient à

une famille de kinases apparentées à la phosphoinositide 3-kinase (PIKK),

inclut également ATR, ATM, DNAPK et SMG-1. FRAP1 est la sous-unité catalytique

de deux complexes de signalisation appelés mTORC1 et mTORC2, qui jouent un

rôle central dans la régulation du métabolisme cellulaire, la prolifération, la survie,

et migration.1 Il a été signalé que

mTOR est un modulateur clé dans le vieillissement, la signalisation mTOR déréglée peut

promouvoir les maladies métaboliques et le cancer et est souvent associée à

inflammation.2,3 L’intérêt général pour mTOR

une cible de médicament est reflétée par le nombre croissant d’inhibiteurs de mTOR

qui ont déjà été approuvés ou sont en cours de développement clinique. 4 − 9Pour définir d’autres utilisations thérapeutiques potentielles et orienter le

développement

de médicaments sûrs et efficaces, il est crucial de bien comprendre la

rôle biologique de mTOR et les effets de son inhibition pharmacologique.10 Idéalement, les études de validation

molécules devraient être menées avec plusieurs sondes chimiques pour augmenter

la confiance de la dépendance de la cible du phénotype observé et

réduire le risque d’interprétation erronée des effets potentiels hors cible.11 Critères de qualité tels que la sélectivité élevée,

mode d’action caractérisé, et un profil pharmacocinétique favorable

sont une exigence pour générer des données biologiques significatives et permettre

traduction de résultats in vitro à des modèles in vivo.12Nous rapportons ici un

molécule sélective semblable à une drogue, mTOR

inhibiteur d’une nouvelle série chimique, 13 qui montre l’efficacité dans des modèles in vivo.

noyau de pyrimidine substitué par morpholine est un structurel commun

motif qui a été largement exploré pour le développement de l’ATP

inhibiteurs mTOR compétitifs.14

efforts pour découvrir les inhibiteurs de mTOR, nous avons également travaillé sur cette

classe composée et identifié CZ830 (1)

et CZ109 (2) comme des pistes de deux différents

série chimique (Figure ​ Figure11) .15,16 Les deux inhibiteurs ont montré submicromolaire modérée

affinité pour mTOR et montré une sélectivité élevée de plus de 100 fois

par rapport à d’autres lipides kinases de la même famille, à savoir le phosphatidylinositide

Les 3-kinases (PI3K) α / β / γ / δ et dépendant de l’ADN

protéine kinase (DNAPK). Figure 1mTOR inhibiteurs de différentes séries de produits chimiques.

A partir de

composés de plomb 1 et 2, sulfone cyclique 3 a été conçu.13,15,16Pour découvrir plus puissant

inhibiteurs de mTOR, nous avons combiné les deux

série, incorporant la fraction sulfone du composé 1 dans le noyau de pyrimide fusionné de 2. En outre

à ce qui a été précédemment rapporté sur les sulfones cycliques, 17 nous avons largement exploré la substitution méthyle sur le

anneau à cinq membres. Comparé à d’autres sulfones à cinq membres, le

l’introduction d’un substituant diméthyl était avantageuse en termes de

puissance, sélectivité ou solubilité et a donné un profil PK bénéfique

par rapport aux sulfopyrimidines à six chaînons. Le substituant morpholine

a été jugée cruciale pour maintenir une puissance et une sélectivité élevées,

tandis que des groupes multiples ont été tolérés sur le fragment d’urée. C’est

compatible avec la structure cristalline mTOR signalée et les modèles à proximité

analogues montrant la morpholine faisant une importante interaction de liaison charnière.14,17,18 Explorer cette série chimique,

nos efforts ont abouti à la découverte de CZ415 (3), Figure ​ Figure11. La synthèse de 3 et de sulfones cycliques apparentées a

été précédemment rapporté13 et est décrit

dans l’information de soutien.

la puissance et la sélectivité de 3 a été évaluée en utilisant

Plate-forme chimioprotéomique de Cellzome ’ Des expériences de liaison de compétition

combiné avec une lecture protéomique sont un outil puissant pour déterminer

la sélectivité des petites molécules contre une grande partie de la

protéome en une seule expérience.19,20 Avec ce

approche, les affinités de liaison du composé ’ s ont été mesurées pour

environ 285 protéines kinases, y compris la famille des lipides et

kinases atypiques. La constante de dissociation apparente pKdapp pour 3 contre mTOR a été trouvée

être de 8,2, tandis que toute autre kinase identifiée dans les expériences, y compris

Les membres de la famille PI3K, qui se sont révélés être des cibles inhabituelles des autres mTOR

inhibiteurs, n’a montré aucune affinité au sein de 1000 fois. Le remarquable

la sélectivité de 3 est représentée sur la figure 22 (une liste détaillée des protéines est fournie dans l’information de support).

profil de 3 à travers un ensemble

de protéines kinases identifiées à partir de lysats mixtes de lignées cellulaires humaines (285

kinases identifiées). Les barres indiquent les valeurs de pKdapp définies comme la concentration de médicament à laquelle

concurrence demi-maximale de la liaison … Pour vérifier cette liaison de 3 à mTOR

entraîne une inhibition

de la signalisation dépendante de mTORC1 et de mTORC2 dans le contexte cellulaire, 3 a été testé dans un essai mécaniste cellulaire. Inhibition de

L’activité du complexe protéique mTORC1 et mTORC2 a été évaluée par surveillance

la phosphorylation de cibles en aval, la protéine ribosomale S6 (S6RP,

en aval de mTORC1) et de la protéine kinase B (= Akt, substrat mTORC2).

Niveaux de phosphorylation pour les deux protéines, pS6RP (S240 / 244) et pAkt

(S473), ont été évalués en format de réponse à la dose à partir de cellules HEK293T après

traitement avec 3. Comme représenté sur la figure ​ Figure33, l’inhibition de la phosphorylation à la fois

les cibles en aval ont donné lieu à une IC50 de 14,5 nM pour pS6RP et

14,8 nM pour pAKT (analyse Western Blot et test d’activité Caspase 3/7)

sont rapportés dans les Informations de Support). Retenir une puissance élevée contre mTOR dans le système cellulaire prouve

inhibition fonctionnelle de la cible et indique une très bonne perméabilité cellulaire

(Kdapp = 6,9 nM déterminé

par un essai de liaison chimioprotéomique à partir d’un lysat cellulaire, voir ci-dessus).

De plus, l’interféron gamma (IFN γ) est libéré dans le sang total

a été utilisé pour tester l’inhibition de mTOR dans les cellules primaires. Traitement de l’ensemble

sang avec des anticorps monoclonaux se liant à un groupe de différenciation

3 et 28 (α CD3 / α CD28) imite la signalisation du récepteur d’antigène

et active la prolifération des lymphocytes T. Costimulation avec Interleukin

2 (IL-2) induit ensuite l’expression du gène de l’interféron gamma (IFNG) et

IFN γ est publié.22 L’immunosuppresseur

l’effet de 3 a été mesuré en détectant l’IFN sécrété γ

après 18 heures dans du sang total humain stimulé, et la CI50 résultante était de 226 nM (Figure 33). Figure 3: Activité de 3 dans des dosages cellulaires: (A) Dépendant de la dose

inhibition de la phosphorylation de S6RP dans HEK293T après 2 h de traitement

de 3, normalisé aux niveaux totaux de S6RP. CI50 = 14,5 nM (IC à 95% de 11,5 à 18,3 nM, n = 4). (B)

Inhibition dose-dépendante de la phosphorylation d’Akt … Nous avons étudié plus en détail les propriétés de 3 dans

essais in vitro dédiés pour la prédiction précoce de l’innocuité des médicaments.

Les cytochromes P450 (CYP) sont une famille d’enzymes qui jouent un rôle majeur

rôle dans le métabolisme des médicaments, et l’interaction avec eux est liée au potentiel

drogues et interactions médicamenteuses et réactions indésirables aux médicaments. En humain

microsomes, aucune inhibition des principales isoformes P450 CYP1A, CYP2C8,

CYP2C9, CYP2C19, CYP2D6 et CYP3A4 ont été observés dans un

fenêtre d’affinité mTOR. D’autres tests pour le cytochrome CYP3A4

n’a montré aucune induction à 10 μ M et aucune inhibition dépendant du temps

(TDI) à une concentration aussi élevée que 50 μ M.En tant que prédicteur

pour la cardiotoxicité, l’activité de 3 contre l’homme

canal ionique cardiaque hERG a été évalué dans une cellule entière

test de patch-clamp dans des cellules HEK293, aboutissant à une IC50 de 48 μ M. Nous étions en outre heureux que 3 ont montré

pas de potentiel génotoxique. Ce n’était ni mutagène dans une mutation bactérienne

dosage (test d’Ames) et n’a pas montré de génotoxicité chez les lymphomes de souris

test (MLA), en présence ou en l’absence de mélange S9 de foie de rat.

Compte tenu des données rapportées ci-dessus pour 3, il n’y avait pas de sécurité

passifs connexes prévus pour ce composé. À côté de la puissance / sélectivité

évaluation et prédiction de sécurité précoce, propriétés physicochimiques

sont importants pour le développement réussi de médicaments ainsi que pour

sondes de haute qualité, qui peuvent être utilisées in vivo.23,24 Le composé 3 a un poids moléculaire modéré (MW 460)

et surface polaire (PSA 114), tous deux dans l’espace chimique souhaité

pour les médicaments biodisponibles. Malgré un coefficient de distribution relativement élevé

(logDpH7.4 4.31), 3 ont montré une bonne solubilité cinétique

(CLND 149.5 μ M) ainsi que la solubilité dans les milieux pertinents,

ce qui est important pour l’administration orale (FaSSIF 11.1 μ g / mL,

FeSSIF 60,1 μ g / ml). La perméabilité mesurée dans un test Caco-2,

prédictif pour l’absorption in vivo de médicaments à travers

la paroi intestinale était modérée (Papp (A-B) 0,47 nm / s et Papp (B-A) 1,02

nm / s). Un tableau résumant les propriétés physicochimiques de 3 est fourni dans l’information de soutien. Les propriétés pharmacocinétiques (DMPK) d’un composé déterminent

ses

capacité à agir au fil du temps sur la cible moléculaire. Un faible taux de drogue

le métabolisme est souhaitable pour les composés à action prolongée pour maintenir une

niveaux de composés dans le plasma. Comme détermination in vitro

de la stabilité métabolique peut aider à prédire la PK in vivo, la stabilité de 3 a été évaluée dans les microsomes et les hépatocytes

de différentes espèces. La clairance intrinsèque faible à modérée a été mesurée,

résultant en un Clint < 0.6 / < 1.1 / 1.5 μ L / min / g

foie dans les microsomes et Clint n.d./<0.8/≤0.5

μ L / min / g foie dans les hépatocytes (rat / chien / humain). En plus de

la stabilité métabolique, mesure de la liaison aux protéines plasmatiques (PPB)

permet l’estimation de la fraction libre du composé dans la circulation sanguine.

La PPB de 3 chez le rat, la souris et le plasma humain a été déterminée

être de 69/89/81% (r / m / h), indiquant une fraction libre

le composé étant disponible pour la liaison à la cible. Pour la caractérisation complète de 3 et

pour permettre une amélioration

prédictions de dose, le profil pharmacocinétique (PK) a été évalué

rat. PK et biodisponibilité orale ont été déterminées après 1 mg / kg par voie intraveineuse

(iv) bolus et administration orale (po) à 3 mg / kg (figure &#200B; figure 44). La clairance plasmatique observée,

correspondant à 45% du débit sanguin hépatique, a suggéré que des niveaux suffisants

de composé libre circulaient dans l’animal au fil du temps. L’oral

l’absorption était rapide avec un Tmax de 0,5 h

et biodisponibilité F = 44% ont indiqué une très bonne absorption

de l’intestin. La concentration plasmatique a atteint un maximum de 0,43 μ M,

était au-dessus de la CI50 déterminée dans les dosages cellulaires pour 3.Figure 4 Concentration plasmatique dépendante du temps de 3 après intraveineuse

bolus (iv, cercle) et la solution orale (po, carré) administration à

les rats. Les rats ont reçu 1 mg / kg (iv, n = 3) ou 3

mg / kg (po, n = 3). Véhicule: 5% DMSO / 95% (10% Kleptose) .Pour démontrer l’efficacité de 3in vivo, la modulation de mTOR proximale en aval

la signalisation a été surveillée

dans un modèle de souris mécaniste. Traitement in vivo avec

anticorps anti-CD3 stimule spécifiquement les cellules T lors de la liaison à

le récepteur CD3 et l’activation subséquente en aval du PI3K / mTOR

voie de signalisation.25 Pour déterminer les effets

de 3 sur sa cible pharmacologique, changements dose-dépendants

dans les niveaux de phosphorylation de S6 Ribosomal Protein et Akt, à la fois en aval

cibles de mTOR, ont été évaluées. L’inhibiteur a été administré par voie orale

à 1, 3 et 10 mg / kg pour les souris 1 h avant le stimulus anti-CD3. Quinze

min après stimulation, les rates ont été disséquées et analysées pour pS6RP

et les niveaux de pAKT. Une inhibition significative liée à la dose de la phosphorylation

à la fois de S6RP et d’Akt a été observé après l’administration du composé (figure ​ figure 55A, C). En particulier,

1 et 3 mg / kg 3 pourraient inhiber complètement la phosphorylation de S6RP

induite par la stimulation anti-CD3, et 10 mg / kg ont également diminué

les niveaux de phosphorylation constitutifs tels que mesurés dans le contrôle

groupe. Alors que la phosphorylation de Akt n’a pas été augmentée sur anti-CD3

stimulation (figure ​ figure55C), 3, déjà à la dose la plus faible de 1 mg / kg, significativement

niveaux constitutifs de pAkt réduits, tels que mesurés dans le groupe témoin.

La relation PK / PD a été déterminée après la mesure du composé

concentration dans le sang, et l’exposition – corrélation de réponse

est représenté sur la figure ​ figure 55B, D. Une CE50 de 0,22 μ M a été mesurée pour pS6RP et

0,055 μ M pour pAkt, qui correspondent bien à la puissance nanomolaire

de 3 dans les tests basés sur les cellules. Ces résultats ont montré que 3 était un puissant inhibiteur de mTOR, qui conservait son activité in vivo dans le modèle de souris anti-CD3. (A) pS6RP

les niveaux

(normalisé au total S6RP) mesuré dans les rates du composé traité

par rapport au groupe de véhicule de la maladie (p < 0,01

pour 1 mg / kg de 3; p < 0.001 pour 3

et 10 mg / kg de 3; une valeur aberrante retirée … L’efficacité in vivo de 3 était alors

évalué

dans un contexte inflammatoire. Dans l’arthrite induite par le collagène (CIA)

modèle, les souris développent de manière fiable une polyarthrite lorsqu’elles sont immunisées contre

le collagène de type II bovin, et ce modèle peut être utilisé pour surveiller

les effets anti-inflammatoires des composés testés. Cela a été montré

que le traitement avec Rapalogs peut inhiber la sévérité clinique de

l’arthrite chez la souris, mais l’effet des inhibiteurs de l’ATP compétitifs

n’a pas été précédemment signalé. Une étude dite semi-établie

la conception a été utilisée pour tester 3 à 10 mg / kg deux fois par jour.

Les souris ont été mises au défi avec deux injections de collagène, la première à

au jour 0 et une injection de rappel au jour 21. L’administration de 3 a commencé au jour 22, immédiatement avant le début de la maladie,

et continué jusqu’au jour 34 à la fin de l’étude. Le développement

de l’arthrite, qui a atteint 100% de l’incidence de la maladie dans le véhicule

groupe, a été déterminée par l’évaluation des scores cliniques d’arthrite

0 à 5) qui ont été mesurés par l’inspection des pattes pour l’érythème

et gonflement. Les scores cliniques quotidiens d’arthrite du groupe traité

diffèrent du groupe de contrôle de la maladie au fil du temps avec des réductions significatives

(p < 0,05) au jour 33 – 34 (Figure ​ Figure66A). Scores cliniques d'arthrite

exprimé en surface sous la courbe (ASC) ont été réduits dans le groupe

traité avec 3 par 59% comparé au véhicule de la maladie

groupe (données non montrées). Aucune différence significative dans la perte de poids corporel

a été observée par rapport à des souris induites par un

fin de l’étude (Figure ​ Figure66B). Mesure des concentrations de composés dans le sang, déterminée

au jour 31, a indiqué que jusqu’à 8 h après le dosage, les niveaux de circulation 3 étaient supérieurs à 50

vitro dans le sang total et in vivo dans le modèle de souris PK / PD (Figure ​ Figure66C) cinétique. Contrairement à de nombreuses molécules anti-inflammatoires qui nécessitent

dosage prophylactique dans la CIA, ces données démontrent que 3 est actif dans une situation plus proche de la maladie humaine.Figure 6Compound 3 dans un modèle de souris CIA. (A) L’arthrite clinique

marquer, toutes les pattes (Scored 0 – 5). Contrôles normaux (carrés blancs):

signification (p ≤ 0,05) du véhicule de la maladie

groupe (carrés noirs) observés du jour 27 au jour 34. Composé 3 au … Nous avons présenté ici un très

puissant inhibiteur de mTOR CZ415 (3) avec exquis

la sélectivité par rapport aux autres lipides et

protéines kinases. Il a un mécanisme d’action défini, qui a été démontré

dans des essais basés sur des cellules mécanistes et phénotypiques, y compris un ensemble

analyse de sang. En plus des propriétés physicochimiques favorables,

évaluation de la sécurité in vitro au début n’a pas exposé

tout passif. Propriétés pharmacocinétiques de clairance modérée

et une bonne biodisponibilité orale a montré une aptitude de 3 pour la progression vers des études in vivo. Dans un anti-CD3

le modèle de souris 3 inhibe efficacement la signalisation en aval de mTOR

et, dans un modèle de souris CIA, a montré des effets anti-inflammatoires significatifs.

Avec sa sélectivité extraordinaire, ses propriétés de médicament et son efficacité

efficacité in vivo, 3 représente un idéal

molécule pour l’étude pharmacologique de mTOR pathophysiologique

rôle in vivo.