Découverte de GSK2126458, un inhibiteur très puissant de PI3K et de la cible mammalienne de la rapamycine

La phosphoinositide 3-kinase La voie de signalisation (PI3K) est activée dans un large spectre de cancers humains.1 L’activation de cette voie se produit souvent indirectement par l’activation des tyrosine kinases réceptrices ou l’inactivation du suppresseur de tumeur de la phosphotase et de l’homologue de la tensine (PTEN). de PI3K a été démontrée avec la découverte de plusieurs mutations activatrices dans le gène PIK3CA lui-même, le gène qui code pour p110 α Il a été démontré que plusieurs des mutations trouvées dans PIK3CA augmentent l’activité de la lipide kinase de PI3K, induisent l’activation des voies de signalisation et favorisent la transformation des cellules à la fois in vitro et in vivo.5 & &numsp &numsp &numsp &numsp &numsp &numsp &numsp &numsp &numsp &numsp &numsp &numsp &numsp   # x02212; 7 En outre, la voie PI3K est la voie de signalisation la plus fréquemment mutée dans les cancers humains.8,9La famille d’enzymes PI3K comprend 15 lipides kinases avec des spécificités de substrat, des profils d’expression et des modes de régulation distincts10. PI3K α a émergé comme une cible attrayante pour les traitements contre le cancer, et plusieurs inhibiteurs de PI3K sont actuellement en cours d’évaluation dans des essais cliniques humains, y compris BEZ235 (Novartis), GDC-0941 (Genentech), PX-866 (ProlX) et XL765 (Exelixis) .11 , 12 Nous décrivons ici la découverte du 2,4-difluoro-N- {2- (méthyloxy) -5- [4- (4-pyridazinyl) -6-quinolinyl] -3-pyridinyl} benzènesulfonamide (GSK2126458, 1, Figure ​ Figure1), 1), un inhibiteur très puissant et sélectif des PI3K de classe I et de la cible mammalienne de la rapamycine (mTOR). Composé 1 est en cours d’évaluation dans une phase I, ouverte, dose-escalade étude chez les sujets avec des tumeurs solides ou lymphome.Figure 1GlaxoSmithKline PI3K composés cliniques.GSK1059615 (2), 13 notre premier composé clinique PI3K, a récemment entré une dose-escalade étude chez des patients atteints de tumeurs malignes réfractaires. Dans les études de suivi, nous avons cherché à identifier un second inhibiteur avec une puissance, une sélectivité et des profils pharmacocinétiques (PK) améliorés. La clé de notre approche pour atteindre les niveaux souhaités d’activité PI3K était de poursuivre la conception basée sur la structure en utilisant la cristallographie de la PI3K γ en tant que protéine de substitution.14 − 17 La structure cristalline liée à l’inhibiteur de 2 dans PI3K γ indiqué que le cycle thiazolidinedione (TZD) a formé une interaction avec la lysine catalytique (Lys833) dans la poche de liaison ATP. Cependant, la structure a également montré que des groupes plus importants pourraient potentiellement être accueillis. Nous avons pensé que remplir l’espace vide dans la poche enzymatique pourrait conduire à des inhibiteurs avec une puissance améliorée et une sélectivité potentielle, ce qui a été la base de la stratégie initiale pour identifier les substituts au fragment TZD. La synthèse de ces dérivés a commencé avec la conversion du 6-bromo. -4-chloroquinoline (3) en l’intermédiaire 4-iodo 4 correspondant, suivi par l’installation du groupe 4-pyridyle dans des conditions de couplage croisé catalysées par du palladium standard pour fournir la quinoléine 5 (Schéma 1). Divers groupes aryle (Ar) ont ensuite été attachés à la position 6 du noyau de quinoléine en utilisant une borylation in situ et un couplage croisé catalysé par palladium pour fournir les analogues désirés. 6.18,19Schéma 1Synthèse des analogues de substitution TZD de PI3K α Les analogues ont également été évalués dans un essai cellulaire mécanique mécanisé, qui a mesuré l’aptitude des composés à diminuer la phosphorylation intracellulaire de l’AKT à S473 ( pAKT-S473) dans les cellules cancéreuses T47D et BT474. Le remplacement du TZD par un groupe phényle simple (6a) a entraîné une perte dramatique de puissance (tableau 1). L’activité était beaucoup moins atténuée à la fois pour la pyridine 6b et l’indazole 6c, bien que ni l’une ni l’autre ne montrât beaucoup d’amélioration dans le test cellulaire par rapport à 6a. Les superpositions de modélisation moléculaire ont indiqué que les azotes de pyridyle et d’indazolyle de 6b et 6c, respectivement, étaient le plus susceptibles de faire des interactions distinctes avec l’enzyme. Nous avons donc fusionné les deux hétérocycles pour former l’azaindazole 6d, ce qui a considérablement augmenté la puissance biochimique et cellulaire. Cocristallisation de 6d avec PI3K γ confirmé que l’azote à la position 2 de l’indazole forme une liaison hydrogène avec Lys833 et que l’azote pyridyle interagit avec une molécule d’eau à site actif conservée (Figure 22).Figure 2 Structure de co-cristal de rayons X de p110 γ avec 6d. La protéine est montrée dans le ruban plein. Les résidus sélectionnés sont indiqués en gris. Les figures 22 et ​ et 33 ont été préparées en utilisant PyMOL.21Table 1TZD Replacement SARAl bien que 6d présente un profil d’activité prometteur, le composé présente une très faible solubilité aqueuse et un mauvais profil PK, caractérisé par une clairance élevée, une courte demi-vie. vie, et un manque de biodisponibilité orale. L’ouverture de la partie pyrazole de l’azaindazole pour donner des analogues de pyridine 2,3,5-trisubstitués conduit à l’identification du pyridylsulfonamide 6e, qui conserve les gains obtenus en puissance et présente une solubilité accrue. Nous avons ensuite examiné la relation structure-activité (RAS) de la fraction sulfonamide et constaté que les arylsulfonamides (p. Ex., 6f) présentaient une exposition orale chez les rats sans perte d’activité inhibitrice (tableau 2). . L’élimination du groupe 2-amino pour donner 6g a encore augmenté l’exposition et multiplié par 3. L’inversion de la connectivité des sulfonamides (6h) a conduit à une augmentation de la puissance biochimique et cellulaire, tout en maintenant l’exposition orale améliorée. Tableau 2: Pyridylsulfonamide analogue Sélection SARaRéintroduction d’un petit substituant en position 2 de la pyridine (par exemple, méthoxy, méthyle, halogène , etc.) a entraîné une augmentation significative de la puissance enzymatique et cellulaire (données non présentées). Nous avons pensé que cela était dû au fait que le substituant remplissait un espace inoccupé profondément dans la poche enzymatique, ainsi qu’un effet potentiel sur l’orientation de la fraction sulfonamide voisine. Des efforts supplémentaires ont montré que l’incorporation d’une pyridazine en position 4 de la quinoléine entraînait une amélioration modérée du profil d’inhibition du CYP par rapport à la pyridine (données non présentées). Ces études ont finalement conduit à l’identification de 1, une inhibiteur puissant de PI3K α (p110 α / p85 α) avec une faible activité picomolaire (PI3K α IC50 = 0,04 nM). Dans les tests biochimiques, le composé 1 est significativement plus puissant que 2 (PI3K α IC50 = 2 nM) et est le plus puissant PI3K α inhibiteur signalé à ce jour. En comparaison avec d’autres inhibiteurs cliniques de PI3K, 1 est ∼ 100 fois plus puissant que BEZ235 (IC50 = 6 nM) 22 et GDC-0941 (IC50 = 9 nM) 23 et ∼ 1000 fois plus actif que XL-765 (CI50 = 39 nM) .11,12 Il est important de noter que 1 est également un inhibiteur à faible picomolaire des mutants d’activation communs de p110 α (E542K, E545K et H1047R) trouvés dans le cancer humain (Tableau 3). De manière similaire aux autres inhibiteurs PI3K rapportés, 1 est également actif contre les autres isoformes PI3K de classe I (&#x003b2 ;, &#x003b3 ;, et δ). Tableau 3 Activité biochimique de la structure de cocristal 1A de PI3K γ dans le complexe avec 1 montre l’inhibiteur lié dans le site de liaison de l’ATP de l’enzyme (figure ​ (figure3) .3). La structure a été déterminée à 2.7 Å résolution et montre, comme 6e, que l’azote pyridyle forme une liaison hydrogène clé avec la molécule d’eau conservée. Le sulfonamide interagit avec Lys833, ce qui crée une forte interaction chargée. Sur la base du pKa du sulfonamide-NH (6.56), 24 &#x0223c, 87% du fragment existe sous sa forme déprotonée à un pH physiologique. Cette interaction chargée peut aider à expliquer la puissance supérieure de 1 par rapport aux autres inhibiteurs de PI3K signalés. De plus, le groupe difluorophényle remplit une région hydrophobe dans la poche arrière de l’enzyme, tandis que l’azote quinoléine forme une interaction avec la charnière (Val882). Figure 3 Structure cristalline cocristalline de p110 γ avec GSK2126458 (1). Le composé 1 présente une excellente sélectivité par rapport aux protéines kinases (> 10 000 fois par rapport aux > 240 kinases évaluées) à l’exception notable de la famille des PI3K de classe IV. mTOR, une protéine kinase PI3K de classe IV, est un régulateur central de la croissance cellulaire et existe dans deux complexes fonctionnels, mTORC1 et mTORC2.25 mTORC2 est proposé pour réguler la phosphorylation de l’AKT S473, et on pense que son inhibition augmente l’efficacité antiproliférative d’un PI3K inhibiteur par double inhibition de la voie PI3K / AKT.26 Le domaine kinase de mTOR est homologue à p110 α la sous-unité catalytique des PI3Ks de classe I, 27 et 1 est un puissant inhibiteur des deux complexes de mTOR avec une activité subnanomolaire (tableau 4). Le composé 1 est également un puissant inhibiteur de la PI3 kinase de classe IV, ADN-PK (IC50 = 0,28 nM). Tableau 4mTOR Activité complexe de GSK2126458 (1) Dans des tests cellulaires mécanistes, 1 a provoqué une réduction significative des taux de pAKT-S473. avec une puissance remarquable (Tableau 5). Compatible avec son activité contre PI3K α et mTOR, 1 inhibe également la phosphorylation d’AKT-T308 et de p70S6K à de faibles concentrations nanomolaires (données non présentées). Le composé 1 induit un arrêt du cycle cellulaire G1 et inhibe la prolifération cellulaire dans un large panel de lignées cellulaires, y compris les lignées de cancer du sein T47D et BT474.Tableau 5 Activité cellulaire mécanique et fonctionnelle de 1 Le profil pharmacocinétique de 1 a été étudié chez quatre espèces précliniques (souris, rat, chien et singe). Le composé présentait une clairance sanguine faible et une bonne biodisponibilité orale (tableau 6). En outre, 1 avait un potentiel minime d’inhiber les isoformes du cytochrome P450 humain (IC50 > 25 μ M vs CYP 3A4, 1A2, 2C9, 2C19 et 2D6) .Tableau 6PKPreclinical Profil de 1aIn dans un cadre in vivo , 1 ont montré une réduction dose-dépendante des taux de pAKT-S473 dans les tumeurs BT474 humaines implantées chez la souris. Dans l’étude, conçue pour mesurer l’ampleur et la durée de la réponse pharmacodynamique (PD), les souris ont été traitées par voie orale avec un médicament, et les niveaux de pAKT ont été déterminées au cours de 24 h. Après une dose unique de 300 μ g / kg, 1 a montré une réponse de DP profonde et soutenue pendant la période d’observation de 10 h, les niveaux de pAKT revenant à ceux du contrôle de 24 h (Figure 4) .4) . Remarquablement, la réponse PD soutenue a été obtenue avec de très bas niveaux circulants de médicament, en accord avec la puissance in vitro élevée de 1. Effet 4PD de 1 dans les xénogreffes de tumeur humaine BT474 après un seul 300 μ g kg − 1 dose orale. Le rapport de pAKT / AKT total a été mesuré et comparé au contrôle. [Sang], concentration de médicament dans le sang en ng mL − 1; NQ, non quantifiable. […] Le composé 1 a également été évalué dans un modèle d’efficacité de croissance de xénogreffe de tumeur humaine BT474 dans lequel des souris ont reçu une seule dose orale cinq fois par semaine pendant 3 semaines. En accord avec l’inhibition de la voie PI3K / AKT / mTOR, le médicament présentait une inhibition de la croissance tumorale dose-dépendante (Figure ​ (Figure5) .5). La dose maximale (3 mg kg − 1) a été bien tolérée dans l’étude. Comme indiqué précédemment, le composé 2 a montré son efficacité dans les xénogreffes BT474 après administration deux fois par jour à 25 mg kg − 1. En comparaison, le composé 1 présentait une efficacité similaire à une dose beaucoup plus faible et une administration moins fréquente.28 Figure 5 Efficacité de croissance tumorale de 1 dans des xénogreffes tumorales humaines BT474, telle que mesurée par le volume tumoral médian (mm). Les souris ont reçu une dose par jour pendant 5 jours / semaine (M ∢ F) pendant 3 semaines (jours 17 − 21, 24 − 28 et 31 − 35). Les barres d’erreur désignent la norme … En conclusion, nous rapportons la découverte de 1, un inhibiteur structurellement nouveau de la voie de signalisation PI3K / AKT / mTOR avec une activité picomolaire contre PI3K α et mTOR. Le composé 1 présente une puissance remarquable à la fois dans les dosages cellulaires mécanistes et antiprolifératifs. Le composé 1 présente également une excellente activité in vivo, mise en évidence par un effet PD persistant à des taux de médicament circulant très bas. L’inhibition de la voie PI3K / AKT / mTOR devrait avoir un effet bénéfique sur le traitement du cancer, et 1 a été avancé dans une étude ouverte de phase I, avec escalade de dose, chez des sujets atteints de tumeurs solides ou de lymphomes.