Études virologiques, sérologiques et antivirales sur un cas humain importé de virus de l’influenza aviaire à virus AHN à Taiwan

Nous décrivons l’évolution clinique et les caractéristiques virologiques du premier cas de grippe HN chez un patient taïwanais; ce patient avait des virus détectables dans les voies respiratoires pendant des semaines, au cours desquelles une mutation RK associée à la résistance à l’oseltamivir est apparue rapidement. L’anticorps anti-HN a été détecté plusieurs jours après l’apparition des symptômes.

HN, oseltamivir, résistanceUne épidémie récente d’un nouveau virus de la grippe aviaire réassorti d’origine aviaire en Chine a suscité de vives préoccupations en raison des infections des voies respiratoires inférieures progressives chez les personnes infectées En août, un total d’infections humaines HN confirmées a entraîné des décès ont été signalés http: // wwwchinacdccn / fr / Diffusion soutenue d’homme à homme de ce virus n’a pas été noté, et seulement des groupes de “transmission interhumaine limitée” de ce virus ont été identifiés Comme nous l’avons rapporté ailleurs , le premier cas importé d’infection à HN a été confirmé chez un homme d’affaires de retour de Suchow, en avril, qui a développé un malaise général et de la fièvre depuis avril, suivi d’une pneumonie bilatérale et d’une insuffisance respiratoire en avril. malgré l’initiation de l’oseltamivir à une dose quotidienne de mg en avril, l’oxygénation de la membrane extracorporelle veinoveineuse ECMO avec la stratégie de ventilation protectrice a été appliquée en avril, et le patient était traité avec succès et libéré de l’hôpital le mai Nous décrivons ici les caractéristiques des virus séquentiellement isolés à partir des voies respiratoires supérieures et inférieures et les réponses sérologiques en corrélation avec l’évolution clinique dans ce cas patient

MATÉRIAUX ET MÉTHODES

Isolement de virus, caractérisation et réponses sérologiques

Les spécimens respiratoires ont été propagés dans des cellules MDCK de rein canin de Madin-Darby La sensibilité des isolats de virus aux inhibiteurs de la neuraminidase et la concentration inhibitrice de neuraminidase ont été déterminées en utilisant le test décrit précédemment. La réaction en chaîne de la polymérase par transcription inverse dans le temps en utilisant le protocole du Centre collaborateur de l’Organisation Mondiale de la Santé à Beijing http: // wwwwhoint / influenza / gisrs_laboratory / collaborating_centres / list / fr / Un fragment de gène de l’hémagglutinine partielle contenant un plasmide a été utilisé comme standard. Estimer la charge virale de HN Les tests d’inhibition de l’hémagglutination et de microneutralisation ont été effectués comme décrit ailleurs L’ARN viral a été extrait des surnageants de culture pour amplifier le génome viral complet en utilisant les amorces de grippe conservées . KF-KF L’étude a été approuvée par la recherche de l’hôpital étude du comité hics RINC

RÉSULTATS

Tendances des charges virales de HN et des réponses d’anticorps anti-HN chez le patient de référence

Bien que le patient ait été traité avec de l’oseltamivir à une dose quotidienne de mg débutant le jour suivant l’apparition de la maladie , une pneumonie évolutive s’est développée et une intubation endotrachéale avec assistance mécanique a été instaurée en avril, suivie d’ECMO en avril suite à une hypoxémie persistante. Dans le premier échantillon d’expectoration prélevé, prélevé quelques jours après l’apparition des symptômes cliniques, on a observé des copies / mL de la charge virale de la figure A dans les expectorations et les écouvillons rhinopharyngés qui ont continué à diminuer après avril; cependant, un rebond de la charge virale dans l’écouvillon de gorge a été observé en avril, et l’émergence de mutations associées à la résistance à l’oseltamivir, position RK avec numérotation de l’azote, a été identifiée et retrouvée dans les échantillons d’expectorations prélevés en avril, jours après le début du traitement par oseltamivir

Figure Vue largeTéléchargement de profils de charge virale et de titres d’anticorps anti-HN chez HN chez le patient A, Profil des charges virales HN dans les expectorations, écouvillonnages de la gorge, écouvillonnages nasopharyngés et échantillons sanguins La charge virale du HN a été déterminée à l’aide du protocole OMS Collaborating Centre à Beijing http: // wwwwhoint / influenza / gisrs_laboratory / collaborating_centres / list / fr / Les nombres sur l’axe des x représentent les dates dans, par exemple, / indique avril B, Profil de l’anticorps contre HN par inhibition de l’hémagglutination HI et microneutralisation Des souches de virus T amplifiées à partir de cellules rénines canines Madin-Darby ont été utilisées dans les dosages HI et MNT pour déterminer les titres d’anticorps anti-HN chez le patient; les colonnes dans B correspondent aux dates dans A Aucun des échantillons sériques de donneurs sains recueillis avant était réactif dans le test HI, avec des titres moyens géométriques & données non montrées Voir Méthodes pour plus de détails sur le protocole de charge virale et les méthodes de dosage. Les charges virales du HN et les titres d’anticorps à HN chez le patient A, Profil des charges virales du HN dans les expectorations, écouvillonnages de la gorge, écouvillonnage nasopharyngé et échantillons de sang La charge virale du HN a été déterminée selon le protocole fourni par le Centre collaborateur de l’OMS. // wwwwhoint / influenza / gisrs_laboratory / collaborating_centres / list / fr / Les nombres sur l’axe des abscisses représentent les dates dans, par exemple, / indique April B, Profil d’anticorps contre HN par inhibition de l’hémagglutination HI et microneutralisation MNT essais Les souches S et T amplifiées de Des cellules de rein canin Madin-Darby ont été utilisées dans les tests HI et MNT pour déterminer les titres d’anticorps anti-HN chez le patient; les colonnes dans B correspondent aux dates dans A Aucun des échantillons sériques de donneurs sains recueillis avant était réactif dans le test HI, avec des titres moyens géométriques & données non présentées. Voir Méthodes pour plus de détails sur le protocole de charge virale et les méthodes de dosageOu avril, l’oseltamivir était changé en péramivir à une dose quotidienne de mg Bien que les charges virales soient restées élevées, aucun virus HN provenant des échantillons des voies respiratoires n’a pu être amplifié dans les cellules MDCK après avril. Une réponse immunitaire positive: contre les virus isolés des échantillons d’expectorations et d’écouvillonnages Des virus S et T ont été observés en mai et une tendance similaire des anticorps a été observée lors d’un test de microneutralisation. Figure Bn Mai Le traitement par méthylprednisolone a débuté à une dose journalière de mg / kg La charge virale de HN dans les échantillons naso-pharyngiens est devenue indétectable en mai, et les charges virales dans les échantillons d’expectorations et de prélèvements de gorge étaient indétectables en mai. Le soutien de l’ECMO a été retiré en mai, et Le patient a été sevré du ventilateur mécanique en mai. Le patient a été sorti de l’hôpital en mai avec une bonne récupération fonctionnelle.

Caractérisation des virus HN des échantillons respiratoires

Les virus HN ont été amplifiés dans des cellules MDCK en utilisant des prélèvements prélevés en avril sur les expectorations et les prélèvements de gorge sur les virus S et T et en Avril sur le prélèvement de la gorge du virus T. Le génome viral complet de ces virus a été déterminé par séquençage. des substitutions acides dans le génome viral HN ont été observées dans les isolats cliniques taïwanais, distinctes de celles rapportées par China Table; ces substitutions sont TN dans le gène NA, VA dans le gène PB, AV dans le gène PB, et LF et QR dans le gène PA

Tableau Comparaison des substitutions d’acides aminés critiques dans les virus HN Grippe A Gene Position des acides aminés Virus humain Taiwana aviaire et environnement Virusb Commentaire S T T Chinac Environnement aviaire HAd V V V V / G / V V GV et QL ont montré une augmentation de la capacité de liaison pour le récepteur de l’acide sialique lié à α L L L L / I / Q / L / Q / L / Q / NAe N N N T T NT est situé au niveau de la tige de la neuraminidase K K K R / K / R R RK est associé à la résistance à l’oseltamivir et au zanamivir dans le virus HN PB A A A V V V … PB V V V A A A … K E EK / E / E E EK réplication du virus chez le mammifère Les voies respiratoires supérieures à basse température F F F F F F F F F F F F F F F F F F F F F F F F F F F F F F F F F F F F F F F N F … F F L L / F / L / F / … R R Q Q Q … NP C P C C C … V I V V / F / V V … M L L P / L / P / L / P / L / … D D E / D / E / D / E / D / … Gène Acide aminé Position Virus humain Taiwana Aviaire et environnement Virusb Commentaire S T T Chinac Environnement Aviaire HAd V V V V / G / V V Il a été démontré que GV et QL augmentent la capacité de liaison pour le récepteur de l’acide sialique lié à α L L L L / I / Q // L / Q / L / Q / NAe N N N T T NT est situé au niveau de la tige de la neuraminidase K K K R / K / R R est associé à la résistance à l’oseltamivir et au zanamivir dans le virus HN PB A A A V V V … PB V V V A A … K E EK / E / E E EK réplication accrue du virus dans les voies respiratoires supérieures des mammifères à basse température F F F F F F F F F F N F F F F F F F F F F F F F F F F F F F F F F F F F F F F F F FSE La DN est corrélée à une transmission accrue chez les cobayes PA N D D D D D … E E K K K … F F F L L / F / L / F / … R R R Q Q … NP C P C C C C … V I V V / F / V V … M L L L P / P / P / P / P / L / … D D E E / D / E / D / E / D / … a Les virus S et T étaient respectivement amplifiés à partir des échantillons d’expectorations et de prélèvements de gorge prélevés en avril; Les virus S, T et T ont été amplifiés brièvement dans les cellules rénales canines de Madin-Darby. A / Taïwan // représente des séquences virales provenant de virus se propageant dans le sac allantoïdien. La cavité amniotique des œufs de poule embryonnés Le spécimen a été dérivé des expectorations et a été recueilli sur Aprilb Les données représentent les séquences HN des isolats aviens et les séquences HN de l’environnement Les nombres entre parenthèses représentent le nombre de séquences présentant les substitutions uniquesc Les données représentent – séquences HN, variant selon fragments de gènes, provenant d’isolats humains en Chine Les nombres entre parenthèses représentent les nombres de séquences présentant les substitutions uniquesd Selon H numberinge Selon N numberingView LargeLes tailles de plaque des virus S amplifiés à partir de l’échantillon d’expectoration étaient plus grandes & gt;% de plaques avec un diamètre & gt; Figure supplémentaire Alors que les virus T avaient la mutation RK, qui est connue pour entraîner une sensibilité réduite à l’oseltamivir et au zanamivir , les virus S présentaient un mélange d’arginine et de lysine. Au résidu du gène NA Aucune autre mutation résistante liée aux inhibiteurs de la neuraminidase n’a été identifiée dans ces isolats gonorrhée . Comme le montre le tableau supplémentaire, les virus S présentaient une résistance modérée à l’oseltamivir, au péramivir et au zanamivir, alors que les virus T et T niveau de résistance à ces inhibiteurs de la neuraminidase En plus de la mutation RK dans le gène NA, des différences uniques entre les virus S et T ont également été observées dans les gènes PB, PA et NP Tableau La substitution GluLys du gène PB a été spécifiquement détectée dans le virus S, alors que seulement -Glu a été détecté dans les virus T et T. A côté de ceux-ci, il n’y a que des différences d’acides aminés entre les virus S et T Les virus S avaient les substitutions LF et DN uniques dans les gènes PB et PA, respectivement, et les virus T avaient des substitutions CP et VI dans le gène NP.

DISCUSSION

Le patient de cette étude présentait une progression rapide de la maladie vers un syndrome de détresse respiratoire aiguë, bien que l’oseltamivir ait été instauré quelques jours après l’apparition des symptômes respiratoires. La durée de l’excrétion virale estimée par transcription inverse en temps réel était de plusieurs semaines. La présence de mutation RK dans le gène de la neuraminidase et une sensibilité réduite à l’oseltamivir, au zanamivir et au peramivir ont été détectées quelques jours après le début du traitement par l’oseltamivir. Les fortes charges virales de HN et la présence de la mutation RK ont également été décrites. Les patients infectés par le HN, les patients et ayant bénéficié du soutien de l’ECMO en Chine L’émergence de la résistance à l’oseltamivir était associée à une clairance virale retardée et à de graves maladies chez les patients infectés par le virus HN aviaire hautement pathogène. l’utilisation de corticostéroïdes contribue à l’effet indésirable clinique Tout d’abord, au cours de la période d’étude d’avril à mai, la charge virale de HN chez notre patient était indétectable dans les échantillons de sérum, contrairement aux résultats observés dans le HN. En deuxième lieu, notre patient a reçu un corticostéroïde quelques jours après l’apparition de la maladie, alors qu’aucun virus HN ne pouvait être mis en culture à partir de patients infectés par le virus HN. des échantillons respiratoires qui coïncidaient avec la montée de l’anticorps neutralisant Figure B, alors que les patients et de Chine recevaient un corticostéroïde au lendemain de l’apparition de la maladie, quand la virémie continuait Équilibrer le risque d’immunosuppression et les bénéfices des corticostéroïdes dans le traitement du syndrome de détresse respiratoire aiguë. , nous avons décidé de commencer les corticostéroïdes après la réplication virale a été contrôlée Cinq substitutions uniques d’acides aminés étaient i Ces substitutions sont principalement distribuées dans les gènes viraux codant des enzymes pour le bourgeonnement et la réplication du virus. La substitution TN dans le gène NA, situé juste avant la délétion de l’acide aminé dans N, a été observée seulement dans N et N mais pas dans d’autres types de gènes neuraminidase La substitution AV dans le PB est localisée dans les résidus du domaine de liaison au cap – dans la numérotation N. Ce résidu dans les virus H aviaire est La substitution QR dans le gène PA n’est observée que dans un isolat de grippe aviaire du poulet A / poulet / Shanhai / C // A / HN mais pas dans H, H, ou H virus grippaux Les rôles fonctionnels de ces substitutions méritent un examen plus approfondi. Néanmoins, comme dans les rapports précédents, les séquences HN publiées provenaient principalement de virus amplifiés. Les hôtes utilisés pour amplifier les virus, les œufs de poule embryonnés dans ses études et MDCK dans cette étude, pourraient conférer une certaine pression de sélection sur la propagation de certaines populations virales. Il est remarquable que les caractéristiques des virus amplifiés des voies respiratoires supérieures et inférieures, S et T, semblent différentes. l’échantillon d’expectoration contenait des plaques plus grandes, contenait un mélange de virus de type sauvage et résistant à l’oseltamivir et présentait une mutation EK, associée à une réplication accrue du virus dans les voies respiratoires des mammifères Les virus T amplifiés à partir des écouvillons avaient des plaques plus petites, ne contenaient que des virus résistants à l’oseltamivir et avaient le résidu aviaire -Glu La présence d’une population mixte de R / K au résidu NA pourrait expliquer les différences de sensibilité des virus S et T aux inhibiteurs de la neuraminidase. , il n’y a que des différences d’acides aminés entre le tableau des virus S et T, et ils sont tous situés dans les gènes liés à la réplication de l’ARN de la grippe n La contribution et les interactions de ces substitutions d’acides aminés à la réplication du virus dans les voies respiratoires supérieures et inférieures restent à étudier. Limitée par le manque de spécimens cliniques du patient avant son admission à notre hôpital, nous n’avons pas pu déterminer s’il a été infecté par les virus résistants à l’oseltamivir ou si les virus résistants à l’oseltamivir provenaient de la pression de sélection par traitement à l’oseltamivir. Néanmoins, un mélange de virus résistants et sauvages a été détecté par séquençage de nouvelle génération sur l’écouvillon prélevé sur la gorge. avril, jour après l’initiation de la communication personnelle oseltamivir, Shih-Ru Shih Si la souche taïwanaise pourrait évoluer rapidement pour développer une résistance à l’oseltamivir et le rôle de la substitution TN dans le gène NA tout le monde justifie une enquête continue

Remarques

Remerciements Nous souhaitons remercier Chi-Huei Wong, président de Academia Sinica, et Shin-Ru Shih, professeur à l’université Chang-Gang, pour leurs commentaires sur cette étude. Nous remercions également les médecins de soins primaires et les infirmières qui ont soigné le patient. et collecter les spécimens cliniques pour cette étude Conflits d’intérêts potentiels Tous les auteurs: Aucun conflit rapporté Tous les auteurs ont soumis le formulaire ICMJE pour la divulgation des conflits d’intérêts potentiels Conflits que les éditeurs considèrent pertinents pour le contenu du manuscrit ont été divulgués