Évaluation du [11C] N-méthyl-lansoprazole comme produit radiopharmaceutique pour l’imagerie TEP des enchevêtrements neurofibrillaires de Tau

On estime que la démence affecte

14000/100000 de la population, 5% de plus de 70 ans et 24% de plus

l’âge de 80.1 La forme la plus commune est

La maladie d’Alzheimer (AD), qui représente 50% du paysage de la démence,

et au moment de l’écriture, plus de 5 millions de cas étaient aux États-Unis

États seuls. La MA est caractérisée par la présence de deux extracellulaires

plaques séniles composées de β -amyloïde (A β) et intracellulaire

les enchevêtrements neurofibrillaires (NFT) constitués de protéine tau agrégée.2 Déclin supplémentaire des systèmes de neurotransmetteurs

comme le système cholinergique se produit simultanément.3 Des travaux importants ont été entrepris pour développer des produits radiopharmaceutiques

qui permettent l’imagerie non invasive des démences telles que AD en utilisant positron

l’imagerie par tomographie par émission (PET).

objectifs de l’imagerie de la physiopathologie de la MA avec la TEP sont (a) le diagnostic de

la condition (historiquement atteint post-mortem) tandis que le patient

est encore en vie et, idéalement, avant le début du déclin cognitif;

(b) la différenciation des sous-types de démence cliniquement chevauchants permettant

gestion clinique appropriée (la précision clinique actuelle est de ∼ 60 – 80%);

(c) la sélection des patients appropriés pour les essais cliniques de thérapeutiques anti-AD;

et (d) la surveillance de la réponse des patients à de tels traitements.

stratégie la plus couramment explorée à ce jour implique l’imagerie du sénile

plaques amyloïdes (récemment examinées4 − 8) parce que, pendant des décennies, la présence de plaques séniles a été la

diagnostic définitif de la MA. De plus, l’hypothèse amyloïde suggérée

que [11C] PiB (Université de Pittsburgh), 11 [18F] flutemetamol (GE Healthcare), 12 [18F] amyvide ([18F] florbétapir,

Avid Radiopharmaceuticals / Eli Lilly), 13 et [18F] florbetaben (Bayer Healthcare / Piramal Healthcare) 14 ont tous été largement développés. Ces composés

tous montrent une absorption corticale élevée chez les patients amyloïdes positifs, mais sont

entravé par la liaison de la substance blanche non spécifique, même chez les amyloïdes négatifs

patients15. La preuve de mécanisme a également

été confirmée par des études d’autopsie pivotales.16,17 [18F] Amyvid a été le premier à se lancer dans le marketing

l’approbation de la FDA américaine, en avril 2012, en tant que diagnostic radioactif

agent pour l’imagerie TEP du cerveau pour estimer A β plaque neuritique

densité chez les adultes. Ces agents devraient être cruciaux si un antiamyloïde

stratégie thérapeutique est identifiée.Cependant, comme plus d’un

trouble neurodégénératif est associé à une pathologie amyloïde [par exemple,

AD et la démence avec des corps de Lewy (DLB)], l’imagerie amyloïde seule est

pas suffisant pour différencier les sous-types de démence. De plus, il a

été montré que l’amyloïde extracellulaire ne correspond pas à cognitive

statut [estimé à l’aide de l’examen d’état minéral (MMSE)]

AD.18 Par contraste, dans le même travail,

Hof et ses collègues ont démontré que la charge intracellulaire tau NFT

est corrélée avec le déclin cognitif, confirmant que les TVN tau sont viables

cible pour la thérapie AD et l’imagerie TEP de la MA. En outre, TFT NFTs

sont impliqués dans de nombreux autres sous-types de démence. Ces tauopathies

inclure la démence frontotemporale (FTD), la paralysie supranucléaire progressive

(PSP), et la dégénérescence corticobasale (CBD) .19 Par conséquent, en plus de AD, un radiopharmaceutique pour quantifier

tau TNE NFT aiderait à la compréhension de la physiopathologie

et la prise en charge clinique de chacune de ces maladies neurodégénératives. Malgré cela, le développement de produits radiopharmaceutiques pour les TVN tau

a été relativement limitée, et ceux qui y sont restent la plupart du temps

confiné à l’arène préclinique. Okamura et ses collègues projetés

> 2000 composés contre tau et quinoléines et benzimidazoles identifiés

comme échafaudages d’intérêt.20 Un certain nombre de

des groupes ont exploré l’échafaudage de la quinoléine, et les deux [11C] BF15620 et [18F] THK52321 semblent avoir une affinité pour la tau et la spécificité

pour tau sur A &#x003b2 ;, bien que l’imagerie clinique préliminaire avec

[18F] THK523 était incapable de distinguer les patients AD de

contrôles sains.22 Autres produits radiopharmaceutiques

pour tau comprennent [18F] T80823 et

[18F] FDDNP, 24 bien que l’utilité

de ce dernier composé est entravé par son affinité à la fois pour tau et

A β .A l’Université du Michigan, nous avons un très

programme actif de neuroimagerie et sont intéressés à avoir la possibilité

Image TFT NFTs. En conséquence, nous avons été attirés par un rapport

Rojo et ses collègues en 2010, qui ont indiqué que le lansoprazole,

un inhibiteur de la pompe à protons approuvé par la FDA, a une affinité nanomolaire pour

certaines formes de tau et la spécificité de la protéine tau par rapport à l’amyloïde.25 Comme le lansoprazole (1) contient

benzoimidazole, cela semblerait correspondre aux conclusions d’Okamura.20 Ici, nous rapportons la synthèse et la

évaluation préclinique de la [11C] N-méthyl

lansoprazole ([11C] LNM, 3).

comment synthétiser un analogue radiomarqué du lansoprazole (Schéma 1), il nous est apparu que le benzoimidazole

fragment était facilement accessible à la méthylation avec [11C] MeOTf,

en utilisant des techniques radiochimiques standard de carbone-11 couramment utilisées

dans notre laboratoire.26 L’identité et la pureté

d’un produit radiopharmaceutique sont confirmées par co-injection du radiomarqué

composé et un échantillon de référence non étiqueté sur un analytique

HPLC. Un étalon de référence (2) a été synthétisé dans 58%

rendement du lansoprazole (1) disponible dans le commerce

traitement à l’iodure de méthyle et caractérisé par RMN, HRMS et HPLC,

qui était d’accord avec les valeurs de la littérature.

norme de référence en main, nous avons procédé au radiomarquage. Un mince

film de lansoprazole (1), dissous dans du THF, a été déposé

sur la boucle HPLC d’un module de synthèse TRACERlab FXc-pro carbone-11.

[11C] MeOTf a ensuite été passé à travers la boucle pendant 5 min à

générer [11C] NML (3), qui a été purifié

par HPLC semipreparative. Reconstitution subséquente de la fraction HPLC

dans une solution saline éthanolique à des doses de [11C] LNM [4,6%

Rendement radiochimique corrigé sur la base de [11C] MeI

(le précurseur de [11C] MeOTf), 99% de pureté radiochimique,

activité spécifique = 16095 Ci / mmol, n = 5] approprié

pour l’évaluation préclinique (et l’utilisation humaine éventuelle) .Schéma 1Synthèse de [11C] LNM et référence Standard Rojo et ses collègues ont rapporté la valeur du log P du lansoprazole à 1,4725 (bien que

une plage de ∼ 1.5 – 2.76, souvent attribuée à la dépendance au pH,

est apparent). Indépendamment de la variabilité de la littérature, excellent

La perméabilité du SNC est attendue pour les composés ayant des valeurs log P dans cette plage. L’analogue N-méthyle synthétisé

On s’attendait à ce que le log P soit légèrement supérieur à celui du parent en raison du groupe méthyle additionnel, et en effet,

nous avons déterminé log Poctanol / eau à être

2.18. Cela rend le [11C] NML légèrement plus polaire que le [11C] PiB et convient parfaitement comme produit radiopharmaceutique pour

Dans ces données, nous avons effectué une microPET [11C] NML chez les rongeurs (n = 2) pour évaluer

cinétique cérébrale du nouveau produit radiopharmaceutique. À notre surprise, il y a

était une absorption cérébrale minimale de [11C] LNM chez le rongeur de base

balayages (Figure ​ (Figure1) .1). Ce manque d’absorption du cerveau

a également été confirmé par des études de biodistribution ex vivo menées à

5, 30 et 60 min (n = 3 à chaque point de temps, voir

l’information de soutien). Initialement,

nous avons suspecté que nous n’avions pas fait les composés 2 et 3. La méthylation erronée de la pyridine, bien que non favorisée

par rapport à la méthylation du benzoimidazole, pourrait conduire à la

résultat observé. La méthylation de la pyridine fournirait du pyridinium

le sel 4, un composé censé apparaître similaire à 2 par spectrométrie de masse et spectroscopie RMN, qui, en tant que

espèces, serait peu susceptible de traverser le sang – la barrière de cerveau

(BBB). Cependant, une réanalyse soigneuse des spectres de masse du composé 2 a révélé des fragments 5 (M + H = 133) et 6 (M + H = 252) mais pas les fragments 7 ou 8, confirmant que nous avions effectivement préparé le dérivé N-méthylé 2 (Schéma 2) .Figure 1Rodent microPET images.Scheme 2 Spectroscopie de masse de l’étalon de référence 2Les données analytiques et le log P favorable ont suggéré que [11C] LNM devrait traverser le

BBB et entrez le CNS secondaire. Nous avons donc considéré des explications alternatives

pour le manque d’absorption du cerveau, et une possibilité était le transporteur

participation car il existe un certain nombre de transporteurs actifs sur le BBB.

Si [11C] NML était un substrat pour l’un d’entre eux, alors il pourrait

être transporté hors du cerveau et conduire à l’apparition de pas de cerveau

absorption sur les balayages microPET. Le coupable le plus probable était la perméabilité-glycoprotéine

1 [PGP, ou multidrug résistance protéine 1 (MDR1)], trouvé dans de nombreux endroits

dans le corps, y compris le BBB. PGP est une cassette de liaison ATP bien connue

transporteur qui peut transporter une large gamme de molécules à travers les deux

membranes intra- et extracellulaires.28

tester cette hypothèse, l’imagerie rongeur microPET a été répété dans le

présence de cyclosporine A, un médicament immunosuppresseur connu pour bloquer

PGP activity.29 Les analyses PET résultantes

(Figure ​ (Figure1) 1) a montré les niveaux plus élevés attendus

de l’absorption cérébrale du LNM [11C], confirmant notre hypothèse. Le manque d’absorption cérébrale éviterait habituellement le développement final.

de [11C] LNM en tant que radiopharmaceutique pour quantifier tau

Charge de TVN Cependant, conscient des différences fréquentes dans la pharmacologie des médicaments

et la pharmacocinétique entre les espèces, nous étions curieux de savoir comment le LNM [11C] se comporterait chez nos primates. Avoir le luxe de

drug na ï singes rhésus disponibles exclusivement pour utilisation dans

travail de développement de microPET, nous avons mené microPET de primate non humain

imagerie (Figure ​ (Figure2A) 2A) avec [11C] LNM.

Notre notion de la variation des espèces s’est avérée être le cas, et [11C] NML semble être un substrat pour le transporteur PGP des rongeurs

mais pas le transporteur de PGP de primate correspondant. Notre attente

est-ce que la pharmacologie et la pharmacocinétique de [11C] LNM

chez les humains ressemblera plus étroitement à celle des primates non humains

que les rongeurs.Figure 2Protection des primates non humains

images.Drawing une région d’intérêt simple (ROI)

autour du cerveau des primates fourni une simple courbe d’activité de temps –

(TAC) pour [11C] NML (Figure ​ (Figure2B).

From2B).

À partir du TAC, absorption du LNM [11C] dans le cerveau sain des primates

était ∼ 1600 nCi / cc maximum à 3 min suivi d’une sortie rapide

à 500 nCi / cc. Ces cinétiques cérébrales sont similaires aux autres radiopharmaceutiques du SNC

que nous avons traduit avec succès dans la clinique (par exemple, [18F] FEOBV pour l’imagerie du VAChT30). Compte tenu de ces résultats prometteurs, notre intérêt pour le développement du LNM [11C] en un produit radiopharmaceutique pour l’imagerie clinique en TEP

de tau TFT est toujours resté. Par conséquent, nous avons exploré la biodistribution

et les profils de métabolisme de [11C] LNM, avant de tourner notre

attention à l’évaluation de la spécificité de [11C] LNM

Pour les TVN tau utilisant l’autoradiographie in vitro. Les modèles de métabolisme et de biodistribution doivent

être évalué pour tout produit radiopharmaceutique candidat envisagé

pour la traduction clinique. Pour les expériences de biodistribution, [11C] LNM a été injecté à des rats Sprague anesthésiés

la veine de la queue (trois par point de temps), puis, les rats ont été autorisés

se réveiller, avant d’être réanesthésié et sacrifié à 5, 30 et

60 minutes après l’injection. Biodistribution a confirmé l’autorisation par les deux

le foie et les reins, conformément aux résultats de la littérature pour

le parent lansoprazole.31 enquêter

métabolisme, le LNM [11C] a été injecté dans un anesthésique Sprague & Dawley

rats par la veine de la queue (trois par point de temps), puis, les rats étaient

autorisé à se réveiller, avant d’être réanesthésié et sacrifié à 5,

15 et 30 minutes après l’injection. Du sang a été prélevé à chaque fois

points et centrifugé pour fournir des fractions de plasma, qui ont été analysés

par HPLC et radio-TLC. L’analyse a démontré une clairance rapide du LNM [11C] du plasma, conformément aux données de la

lansoprazole, 32,33 et a révélé la présence de

un seul métabolite radioactif polaire. On suppose que le LNC [11C] suit une voie métabolique similaire à celle identifiée pour

lansoprazole32,33 et que le métabolite polaire

est susceptible d’être le 5-hydroxy-N-méthyl lansoprazole ou

le dérivé de [11C] NML sulfone. Fait intéressant, suivant

aucune des études sur les animaux rapportées ici, les filtres à charbon sur

les sorties des chambres d’anesthésie ont également été découvertes pour être

radioactif. Ceci est indicatif de la présence d’un métabolite exhalable

et on pense que c’est le résultat de l’oxydation du carbone-11 méthyle

groupe à [11C] MeOH ou peut-être même [11C] CO2.Validation préliminaire du LNM [11C] en tant que

le radioligand pour les TVN tau a été étudié en utilisant des expériences d’autoradiographie.

Nous avons déjà développé une lignée de rats transgéniques exprimant

tau humain (hTau + / +, résultats non publiés). En raison de la dépense,

cette ligne n’a pas été soutenue, mais tous les cerveaux ont été récoltés à la mort

de l’animal, tranché par microtome, et apposé sur des lames de microscope.

La présence de tau humain a été confirmée par immunocytochimie (voir

l’information de soutien), et humain

tau était clairement présent dans le cortex et l’hippocampe du transgénique

hTau + / + cerveau de rat (Figure ​ (Figure3A) 3A) mais absent

dans des zones analogues de tranches de cerveau de rat de type sauvage (WT) (figure ​ (figure 3B) .3B). Des tranches des deux cerveaux hTau + / + (n = 3) et WT (n = 3) ont été incubées avec

différentes quantités de LNM [11C] avant d’être rincées et analysées

avec un imageur de phosphorescence (Figure ​ (Figure3C).

While3C).

Alors que 66 nCi / mL (1 mCi ajouté à 15 mL) et 330 nCi / mL (5 mCi ajoutés

à 15 mL) les images étaient claires, > 660 nCi / mL (10 mCi ajoutés à 15 mL)

prouvé trop de radioactivité et saturé l’image. Les images

obtenues à partir des plus faibles quantités de radioactivité

a montré une absorption de [11C] LNM dans le cortex et l’hippocampe

régions, en accord avec les résultats d’immunocytochimie. Densitométrique

l’analyse des images a confirmé que l’absorption était de 12% plus élevée

hTau + / + cortex et 4% plus élevé dans le hTau + / + hippocampe

zones correspondantes des cerveaux WT.Figure 3Autoradiographie de hTau + / + et WT rat

sections du cerveau avec des expériences [11C] NML.Autoradiographical ont également été menées

en utilisant des blocs de cerveau humain. PSP est un trouble dégénératif connu pour

être associée à une pathologie tau significative.34 Par conséquent, un certain nombre de cas de PSP avec pathologie tau dans le globus

pallidus et les régions avoisinantes ont été sélectionnées pour enquête (n = 4, tranche d’âge de 59 à 75 ans). Des blocs de cerveau ont été tranchés

en 20 μ m sections en utilisant un cryostat, apposé sur des diapositives, et

incubé avec du [11C] LNM pendant 10 minutes. Après cette heure, des diapositives

ont été lavés, séchés et exposés à un film pendant 5 min. Les résultats (Figure ​ (Figure4) 4) montrent la liaison de [11C] NML à certains

zones du globus pallidus. Après l’autoradiographie, les diapositives

ont été soumis à une coloration de Bielschowsky modifiée, destinée à identifier les NFT tau dans les sections du cerveau PSP.

Figure ​ Figure44 confirme la co-localisation du LNM [11C] avec la coloration de Bielschowsky, offrant des preuves supplémentaires

[11C] NML se lie à tau NFTs.Figure 4Comparaison de la liaison [11C] NML avec la coloration Bielschowsky dans les sections du cerveau PSP.Enfin, confiant que [11C] NML a

affinité qualitative pour tau et potentiel pour l’imagerie in vivo de

tau NFT dans la clinique, l’attention a été tournée vers la quantification

l’affinité avec les études de liaison de saturation et l’analyse de Scatchard.

Pour le lansoprazole, Rojo a rapporté Ki = 2,5

nM contre les filaments tau induits par l’héparine et proposés, à partir de l’amarrage

études, que le benzimidazole NH a formé une liaison hydrogène clé avec

l’hexapeptide C-terminal (386TDHGAE391) du noyau tau.25 Par conséquent, il était d’une importance critique dans

le présent travail pour déterminer quel effet remplaçant le NH avec N – 11CH3 avait sur l’affinité de [11C] NML

pour tau. Par conséquent, nous avons mené des études d’affinité de liaison et étudié

liaison non spécifique (voir l’information de support) entre le [11C] LNM et les filaments tau induits par l’héparine analogues

à ceux utilisés par Rojo.25 Ces études

Kd et Bmax confirmés du [11C] LNM contre la protéine tau induite par l’héparine à 700 pM et 0,214 fmol / μ g,

respectivement. Ainsi, en remplaçant le NH par N – 11CH3 semble effectivement améliorer l’affinité de l’échafaudage

pour tau par un facteur de 3. Il n’est pas immédiatement évident pourquoi cela devrait

être, mais peut-être, le groupe méthyle est capable de s’asseoir dans une poche de liaison

sur la protéine et améliorer les interactions. Enquêtes sur l’élucidation

le site de liaison actuel est en cours à ce moment-là.

Une étude de preuve de concept a confirmé que le lansoprazole est un échafaudage

d’intérêt pour le développement d’un produit radiopharmaceutique pour quantifier tau

Charge de NFT in vivo en utilisant l’imagerie TEP. Une synthèse efficace de [11C] N-méthyl lansoprazole a été développée,

et l’évaluation préclinique préliminaire suggère que le composé

a une affinité pour les NFT tau. La corrélation entre les TVN et cognitives

le déclin de la DA justifie le développement de tels produits radiopharmaceutiques,

et la synthèse de [18F] lansoprazole ainsi que la poursuite

la validation que l’échafaudage vise TFT NFT sont en cours à

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