Infection chronique à Pseudomonas aeruginosa dans la maladie pulmonaire obstructive chronique

ContexteLes infections à Pseudomonas aeruginosa sont de plus en plus associées à des exacerbations aiguës de la bronchopneumopathie chronique obstructive BPCO Nous avons cherché à déterminer si une infection chronique sous-jacente pouvait être à l’origine de ce processus et à déterminer les caractéristiques épidémiologiques des isolements impliqués. Des isolats de P aeruginosa obtenus à partir d’échantillons respiratoires de 13 patients atteints de BPCO et d’échantillons sanguins de 10 patients en réanimation ont été étudiés. 8 patients atteints de BPCO ont été isolés pendant cinq épisodes d’exacerbation séquentielle. les relations génétiques ont été analysées dans tous les isolats. Résultats Les patients atteints de MPOC étaient habituellement infectés par un clone 1 P aeruginosa resté dans le poumon pendant des années, sans signe de transmission interpatiente. Au cours d’une infection chronique, chaque clone s’est diversifié. conduit à la coexistence d’isolats avec différents morphotypes et susceptibilité aux antibiotiques Globalement, P aeruginosa a évolué vers un taux de mutation accru, une résistance accrue aux antibiotiques et une réduction de la production de protéases Les isolats d’échantillons de poumons infectés tendent à être moins cytotoxiques et motiles et à produire plus de biofilm Ces résultats fournissent la première preuve soutenant l’hypothèse que P aeruginosa provoque des infections chroniques dans la MPOC, avec des profils d’infection et d’évolution qui ressemblent à ceux observés dans la fibrose kystique. L’expérience acquise dans le traitement de la fibrose kystique pourrait être utile pour la mise en œuvre de nouvelles procédures pour la prévention, le diagnostic et le traitement de l’infection par P. aeruginosa dans la BPCO

Patients atteints de bronchopneumopathie chronique obstructive La MPOC s’accompagne souvent d’exacerbations aiguës AECOPD ayant un impact majeur sur la qualité de vie des patients Ces exacerbations constituent la principale cause de mortalité chez les patients atteints de cette maladie [1] Bien que les causes de l’AECOPD ne soient pas encore bien compris, on pense que les infections bactériennes sont impliquées dans environ la moitié des cas [2, 3] Des études approfondies de la microbiologie des voies respiratoires des patients atteints de BPCO sont néanmoins nécessaires pour déterminer clairement le rôle de l’infection chez les patients. le pronostic de la maladie Pseudomonas aeruginosa commence à être reconnu comme un agent pathogène pertinent dans la BPCO qui est associée à une inflammation intense des voies respiratoires et à un mauvais pronostic pour les personnes atteintes de la maladie [4, 5] La prévalence de l’infection par P aeruginosa dans l’AECOPD est estimée être ~4% mais augmente jusqu’à 13% chez les patients présentant une obstruction avancée des voies aériennes [6] La mise en œuvre de protocoles adéquats pour prévenir L’infection à P. aeruginosa pourrait donc contribuer à atténuer la mortalité et la morbidité associées à la MPOC. Pour atteindre cet objectif, il faut obtenir plus d’informations sur la structure de la population et les caractéristiques physiopathologiques de P. aeruginosa qui causent l’infection dans le contexte de la MPOC En ce sens, nous disposons encore de très peu d’informations pour savoir si les AECOPD sont principalement des infections aiguës à P. aeruginosa dans un contexte de MPOC ou si elles reflètent au contraire une exacerbation aiguë d’un processus chronique d’infection. La forte prévalence des souches hypermutables La BPCO, qui est un marqueur typique des infections chroniques mais non des processus aigus [7-9], plaiderait en faveur de cette dernière possibilité. On a longtemps reconnu que P aeruginosa avait une importance primordiale dans le développement, le pronostic et le devenir des kystes. fibrose CF, une autre maladie grave qui entraîne une détérioration chronique de la fonction pulmonaire Bien que les causes de ces deux maladies sont c Il a été établi que certains symptômes, tels que l’hypersécrétion de mucus ou la diminution de la clairance muqueuse, qui contribuent à la morbidité sont communs aux deux maladies, et il a été suggéré que l’information obtenue du traitement des patients thérapies efficaces et tests diagnostiques pour la prise en charge de la MPOC [10] L’utilité des antibiotiques pendant l’AECOPD reste controversée, principalement parce que seulement 40% à 50% des exacerbations peuvent être attribuées aux bactéries [2] Dans le cas de P aeruginosa Les informations issues des décennies de traitement des patients atteints de mucoviscidose peuvent être utiles pour le développement de thérapies utiles pour la prise en charge de la MPOC. Bien qu’il ait été discuté que l’AECOPD puisse être attribuée aux pathogènes bactériens seulement lorsque de nouvelles souches sont isolées pendant les exacerbations [3] Il faut noter que les patients fibro-kystiques présentent des exacerbations aiguës même s’ils sont chroniquement infectés [11], et le risque De même, un lien entre l’infection chronique et l’EAMPOC pourrait être possible, et l’évaluation de cet aspect de la MPOC est pertinente pour établir de nouvelles stratégies thérapeutiques. Dans la présente étude, nous avons analysé la dynamique de la population. et quantifié la production de déterminants de virulence dans des isolats de P aeruginosa provenant d’échantillons respiratoires de patients atteints de MPOC et d’échantillons de sang de patients en soins intensifs, dans le but de définir les caractéristiques physiopathologiques des souches de P aeruginosa infectant les patients atteints de MPOC. isolats qui produisent des infections aiguës À notre connaissance, nos résultats fournissent la première indication que les patients atteints de MPOC peuvent souffrir d’infections chroniques à P. aeruginosa qui persistent entre les épisodes AECOPD Les caractéristiques épidémiologiques et pathophysiologiques des bactéries qui produisent ces infections sont très similaires à celles déjà trouvées chez les patients atteints de mucoviscidose Ainsi, les procédures de diagnostic, les traitements antibiotiques et les protocoles de confinement mis en œuvre avec succès chez les patients atteints de mucoviscidose pourraient être utiles chez les patients atteints de MPOC qui ont une infection à P. aeruginosa.

Patients, matériaux et méthodes

Souches bactériennes, conditions de croissance et test de sensibilité aux antibiotiques Les souches bactériennes utilisées dans cette étude ont été obtenues à l’hôpital Son Dureta, Palma de Majorque, Espagne. Huit des patients atteints de MPOC ont présenté des épisodes séquentiels documentés de souches d’infections respiratoires de P aeruginosa appelées «MPOC» et 5 ont présenté un premier épisode d’infection attribuable à ces souches de micro-organismes nommés «L». La qualité des échantillons respiratoires était évaluée par coloration de Gram avant traitement pour la culture, selon les recommandations établies [13] Tous les patients pour lesquels le premier isolat de P aeruginosa a été inclus avaient au moins 1 culture d’expectoration négative pour P aeruginosa au cours de l’année précédente

Tableau 1View largeDownload slideCaractéristiques d’isolats ou de souches cliniques de Pseudomonas aeruginosa Tableau 1View largeDownload slideCaractéristiques d’isolats ou de souches cliniques de Pseudomonas aeruginosaEn outre, 10 souches isolées par culture d’échantillons de sang provenant de 10 patients des unités de soins intensifs «H» ont été incluses à des fins comparatives. ont choisi des isolats de culture de sang parce que la bactériémie indépendante de l’objectif principal est la meilleure représentante d’un processus d’infection aiguë. La bactériémie chez ces patients incluait: pneumonie 4 patients, infection de la plaie 2, infection urinaire 2, infection liée au cathéter 1 et infection d’origine inconnue 1 Aucun des patients ne présentait une maladie hématologique primaire. Des souches de P aeruginosa étaient cultivées en milieu de Luria-Bertani. Pronadisa Des tests de motilité pour évaluer la nage, l’essaimage et les contractions étaient effectués comme décrit ailleurs [14] Plaques d’agar Pronadisa h utilisation des bandes Etest AB Biodisk, selon les recommandations des fabricants Rifampin 300 μg / ml fréquences de mutation de résistance ont été déterminées comme décrit ailleurs [8] Épidémiologie moléculaire La parenté épidémiologique des souches a été étudiée par PFGE [15] ADN bactérien intégré dans Des bouchons d’agarose, préparés comme décrit ailleurs [7], ont été digérés avec l’enzyme de restriction SpeI. La séparation de l’ADN a été réalisée dans un appareil CHEF-DRIII Bio-Rad avec 6 V / cm2 pendant 26 h, avec des temps d’impulsion de 5-40 s Les profils de macrorestriction de l’ADN ont été interprétés conformément aux critères établis par Tenover et al. [16] Analyse quantitative de la production de facteurs de virulence Pour les essais de biofilm, des bactéries ont été cultivées dans des plaques de dosage flexibles en silicone MicroTest III Falcon 3911 comme décrit ailleurs [14], en colorant les biofilms avec Crystal Violet et en déterminant leur absorbance à 570 nm. Production de pyoverdine et de pyocyanine Les souches bactériennes ont été cultivées à 37 ° C dans un bouillon liquide contenant 2% de peptone, 1% de sulfate de potassium et 014% de chlorure de magnésium pendant 40 h pour la quantification de la pyocyanine ou dans le bouillon Luria-Bertani pendant 24 h secondaire. La quantité de pyocyanine a été évaluée en mesurant l’absorbance des surnageants à 690 nm. La quantité de pyoverdine a été mesurée par fluorescence en excitant les surnageants à 400 nm et en mesurant l’émission à 460 nm. La production de protéases a été mesurée par fluorescence. Les bactéries ont été cultivées pendant une nuit dans un bouillon Luria-Bertani à 37 ° C, centrifugées et testées pour l’activité protéolytique dans les surnageants de culture. L’activité de la caséinase a été testée en utilisant l’azocaséine comme substrat [17] a été déterminée en utilisant le rouge d’élastine-Congo comme substrat [17] Cytotoxicité contre la lignée cellulaire macrophage J774 ou A549 br la lignée cellulaire épithéliale onchiale a été quantifiée [18] avec le Kit de détection de la cytotoxicité LDH; Roche selon les instructions du fabricant Cent pour cent cytotoxicité a été estimée en lysant les cellules non infectées avec 2% vol / vol Triton X-100 Sigma-AldrichPour comparer la production de facteurs de virulence entre toutes les souches, nous avons divisé les valeurs obtenues pour chaque isolat par la valeur moyenne pour tous les isolats Le log & gt; 2 des valeurs obtenues a été utilisé pour une analyse de classification hiérarchique à l’aide d’un logiciel disponible sur le site Web d’Eisen Lab [19]

Résultats

Epidémiologie moléculaire, morphotype et taux de mutation Des isolats de Serial P aeruginosa ont été retrouvés chez 8 patients atteints de MPOC ayant présenté une AECOPD. Comme le montre le tableau 1, la colonisation d’un patient par différents clones n’était pas fréquente, et même chez ces patients COPD2, COPD6 et COPD7, une fois qu’un clone a été établi, il est resté longtemps dans les poumons du patient. Les clones étaient spécifiques pour chaque patient, ce qui a montré que, au moins dans cette cohorte, il n’y avait pas de transmission interpatiente. L’infection CF se diversifie pendant l’évolution de l’hôte, avec différents isolats provenant du même patient présentant différents morphotypes et antibiothérapies [20] Comme le montre le tableau 1, nos résultats indiquent que la même situation peut être observée chez les patients atteints de MPOC, y compris petites variantes de colonies et morphotypes mucoïdes, caractéristiques d’une infection chronique associée à la mucoviscidose [21]. Ces morphotypes persistaient chez le patient, chez moins pour la durée de notre étude 1P aeruginosa souches hypermutables sont isolées d’un pourcentage élevé de patients atteints de mucoviscidose qui ont des infections chroniques, contrairement à ce qui est observé dans les infections aiguës [8, 9] Nous avons observé une situation similaire chez les patients Tableau 1, dans lequel les isolats provenant uniquement de la colonisation chronique présentaient des phénotypes hypermutables. Résistance antibiotique En tendance générale, une évolution vers des niveaux plus faibles de sensibilité aux antibiotiques a été observée chez tous les patients, bien que certaines variations aient finalement été observées comparent les isolats COPD1a et COPD1c au tableau 1 La coexistence de 2 isolats provenant du même clone P aeruginosa mais avec présentation de différents profils de sensibilité aux antibiotiques a été observée pour les isolats COPD5a et COPD5b du patient COPD5 et COPD7c et COPD7d pour le patient. La valeur MIC la plus élevée pour chaque antibiotique a toujours été observée dans les isolats obtenus aux derniers stades de la colonisation chronique des patients atteints de COPDVir Facteurs de virulence La production des facteurs de virulence a été quantifiée comme décrit dans la section «Patients, matériaux et méthodes». Une grande variabilité du niveau de production a été observée chez tous les types d’isolats, quelle que soit leur origine. de ceux de la BPCO chronique La plupart des isolats de l’infection pulmonaire non chronique regroupés près de certains isolats de MPOC et indépendamment, ainsi que des isolats de la culture de sang figure 1

Figure 1View largeTélécharger une analyse quantitative de l’expression de phénotypes pertinents pour la virulence de Pseudomonas aeruginosa dans des isolats cliniques d’échantillons respiratoires de patients atteints de bronchopneumopathie chronique obstructive BPCO et des échantillons de sang de patients dans l’unité de soins intensifs La carte thermique de la classification des différents isolats en fonction de la production des déterminants de la virulence Le vert indique que la production est inférieure à la moyenne; le rouge indique que la production est supérieure à l’épithélium moyen, épithélial; H, isole de la culture de sang; L, P aeruginosa souches impliquées dans l’infection pulmonaire non chronique; macro, macrophageFigure 1View largeTélécharger slideAnalyse quantitative de l’expression de phénotypes pertinents pour la virulence de Pseudomonas aeruginosa dans des isolats cliniques d’échantillons respiratoires de patients atteints de broncho-pneumopathie chronique obstructive BPCO et d’échantillons sanguins de patients dans l’unité de soins intensifs les différents isolats en fonction de la production des déterminants de la virulence sont indiqués Le vert indique que la production est inférieure à la moyenne; le rouge indique que la production est supérieure à l’épithélium moyen, épithélial; H, isole de la culture de sang; L, P aeruginosa souches impliquées dans l’infection pulmonaire non chronique; La tendance la plus évidente est que les souches de P aeruginosa infectant de façon chronique les patients atteints de MPOC ont tendance à produire des niveaux plus faibles de caséinase, d’élastase et de pyocyanine, alors que la production de pyoverdine est plus répartie. Les souches de BPCO produisent plus de biofilms et leur cytotoxicité est altérée. par rapport aux souches provenant de cultures sanguines Le niveau d’expression plus faible des facteurs de virulence est moins clair dans le cas de souches isolées dans les poumons de patients sans signe d’infection chronique, par exemple les isolats L1, L2 et L5 du tableau 1. Le phénotype, intermédiaire entre les souches BPCO et H, reflète probablement les caractéristiques physiopathologiques de P aeruginosa dans les premiers stades de l’évolution au cours de l’infection par la MPOC. Les souches de la colonisation chronique ont montré une diminution générale de la nage, de l’essaimage et contraction motilité que les souches impliquées dans pulmonaire nonchronique Comme tendance générale, la motilité de la natation et des contractions a diminué avec le temps au cours de l’évolution de l’infection chronique. Il a été récemment rapporté que la capacité d’essaimage est associée à une augmentation de la production de facteurs de virulence [22] En accord avec cette affirmation, nous avons trouvé que les souches présentant une forte capacité d’essaim produisaient également des facteurs de virulence à des niveaux élevés.

Figure 2View largeDownload slideMotilité des isolats cliniques de Pseudomonas aeruginosa provenant d’échantillons respiratoires de patients atteints de broncho-pneumopathie chronique obstructive BPCO et échantillons sanguins de patients hospitalisés en unité de soins intensifs Essais d’essaimage, de natation et de secousses musculaires. la même échelle La motilité dans l’essai d’essaimage avait une plage de diamètre de <05 à 24 cm Donc, seules les images de ces souches avec une motilité> 2 cm de diamètre sont montrées Dans tous les cas, la première colonne indique la motilité de nage, la seconde indique des contractions, et la troisième indique une motilité d’essaimage Certains patients ont été infectés par des clones ⩾2 Les clones qui étaient différents sont mis en évidence par un carré * Souches avec une motilité d’essaimage très élevée montrée à une échelle moitié d’autres images d’essaimage , isole de la culture de sang; L, P aeruginosa souches impliquées dans l’infection pulmonaire non chronique; LM, diamètre de motilité de bas niveau, & lt; 2 cm; images non montrées; NM, pas de motilité dans ce diamètre d’essai, <05 cm; Images non représentées Figure 2Vue plus largeTéléchargement des isolats cliniques de Pseudomonas aeruginosa provenant d'échantillons respiratoires de patients atteints de broncho-pneumopathie chronique obstructive BPCO et d'échantillons sanguins de patients des unités de soins intensifs Essais d'essaimage, de natation et de secousses musculaires sont à la même échelle La motilité dans l'essai d'essaimage avait une plage de diamètre de <05 à 24 cm Donc, seules les images de ces souches avec une motilité> 2 cm de diamètre sont montrées Dans tous les cas, la première colonne indique la motilité, la seconde indique des contractions, et la troisième indique une motilité grouillante. Certains patients ont été infectés par des clones ⩾2. Les clones qui étaient différents sont mis en évidence par un carré. essaimant H, s’isole de la culture de sang; L, P aeruginosa souches impliquées dans l’infection pulmonaire non chronique; LM, diamètre de motilité de bas niveau, & lt; 2 cm; images non montrées; NM, pas de motilité dans ce diamètre d’essai, <05 cm; images non affichées

Discussion

D’abord, un seul clone infecte chaque patient, et il n’y a aucune preuve de transmission interpatient de clones épidémiques. Deuxièmement, il y a une tendance dans les souches. impliqués dans les infections chroniques de la MPOC vers une augmentation du taux de mutation et de la résistance aux antibiotiques, tandis que la cytotoxicité et la motilité, ainsi que les niveaux d’expression de la pyocyanine et des protéases, diminuent, ce qui pourrait favoriser la survie à long terme des CF [35] Les isolats du poumon, où ils se fixent sur les surfaces, tendent à produire des quantités plus importantes de biofilm que ceux trouvés dans les échantillons d’hémoculture Enfin, l’évolution radiative de P aeruginosa est observée chez les patients atteints de BPCO chroniquement infectés. du même patient appartenait au même clone, différents morphotypes ont été obtenus, de même que les fluctuations de la sensibilité aux antibiotiques. Par exemple, le patient COPD1 avait 3 isolats mucoïdes clonaux, et malgré la pression sélective due à l’antibiothérapie, le second isolat était plus sensible à certains antibiotiques que le premier. L’hypothèse la plus appropriée pour expliquer cette évolution est la coexistence de souches avec Différents phénotypes appartenant au même clone chez chaque patient Un exemple de cette situation a été observé chez le patient COPD5, pour lequel 2 isolats COPD5a et COPD5b ont été obtenus le même jour et présentaient des phénotypes de susceptibilité aux antibiotiques différents, bien que les isolats appartenaient au même clone En plus du fait que les souches de l’hypermutateur P aeruginosa sont fréquemment isolées chez les patients atteints de BPCO, toutes ces données suggèrent fortement que le processus infectieux de P aeruginosa est similaire dans la mucoviscidose et la BPCO. avec CF pour mettre en œuvre de meilleures procédures pour le diagnostic bactériologique et le traitement des infections dans En général, nous suggérons l’analyse du phénotype de la souche & gt; 1 chez les patients avec infection à P. aeruginosa associée à l’AECOPD. Un mélange de souches avec différents niveaux de sensibilité aux antibiotiques est possible, et l’information pour 1 seul de ces isolats peut qualifier incorrectement l’infection comme antibiotique susceptible de conduire à des choix antibiotiques incorrects – un scénario similaire à celui des isolats CF [20] Il est possible qu’un manque d’information sur les niveaux réels de sensibilité aux antibiotiques dans la population bactérienne complexe puisse infecter les patients atteints de MPOC Les données présentées dans cet article sont encore préliminaires, et des études plus approfondies sont nécessaires pour faire des déclarations définitives Cependant, la comparaison du processus d’infection chronique de P aeruginosa chez les patients avec BPCO avec le processus largement étudié dans CF pourrait fournir quelques indices pour la gestion de la t son processus Le profil d’infection dû à P. aeruginosa chez les patients atteints de mucoviscidose est généralement similaire à celui décrit ici dans les pays où l’infection à P. aeruginosa est traitée à domicile. Dans ces conditions, la transmission inter-patiente est rare. traitement antibiotique en milieu hospitalier, il a été rapporté que quelques clones réussis sont responsables de la majorité des infections [37] Dans ce cas, le contact fréquent patient-patient dans les hôpitaux ou dans les camps de vacances [38] permet la sélection de bactéries Comme les AECOPD sont habituellement traitées dans les hôpitaux, des mesures préventives de confinement doivent être envisagées afin d’éviter la possibilité d’une infection croisée par ces types de souches de P aeruginosa chez les patients atteints de BPCO. utilisé pour le traitement des patients atteints de mucoviscidose pourrait également être considéré comme une alternative dans le traitement Cela peut inclure le maintien de la thérapie antimicrobienne qui réduit la détérioration de la fonction pulmonaire des patients atteints de CF [12, 39] ou un traitement agressif de la colonisation pulmonaire P aeruginosa avant les marqueurs typiques de l’infection chronique P aeruginosa, par exemple, l’hypermutation sélectionnés, parce qu’une fois l’infection chronique établie, l’éradication devient presque impossible [39, 40] Notre étude soutient l’hypothèse que, au moins dans cette cohorte de patients et pendant la période étudiée, P aeruginosa peut produire une infection chronique chez les patients atteints de BPCO. processus d’infection observé, avec chaque patient infecté par 1 clone bactérien qui persiste pendant des années et avec un modèle spécifique d’évolution pendant l’infection, ressemble à la situation avec CF. Pour confirmer ces résultats, plus d’études sont nécessaires, avec un plus grand nombre de patients fois, mettre en œuvre de meilleures stratégies de prévention et de traitement des infections chez les patients MPOC

Remerciements

Nous adressons nos remerciements à Carolina Alvarez-Ortega pour la correction d’anglais. Soutien financier du Ministère de l’Education et de la Science à AF, Union Européenne LSHM-CT-2005-518152 et LSHM-CT-2005-018705 à JLM, Ministère de l’Education et de la Science BIO2005-04278 à JLM Ministerio de Sanidad y Consumo SAF2003-02851, REIPI C03 / 14, et REIPI RD06 / 008 à AOPotential conflits d’intérêts Tous les auteurs: pas de conflits