Les concentrations sériques de cytokines ne sont pas parallèles à la production de cytokine induite par Mycobacterium tuberculosis chez les patients atteints de tuberculose

Nous avons mesuré les concentrations de cytokine sérique et la production de cytokine stimulée par Mycobacterium tuberculosis par les cellules mononucléaires du sang périphérique PBMC provenant de personnes infectées par M tuberculosis Les concentrations sériques d’interféron-γ IFN-γ et d’interleukine-IL étaient élevées chez les patients tuberculeux En revanche, les PBMC stimulées par la tuberculose chez les patients tuberculeux ont produit moins d’IFN-γ et d’IL- mais des quantités similaires d’IL-, comparativement aux PBMC provenant de sujets sains ayant eu des réactions à la tuberculine. tests cutanés Le prétraitement de PBMC chez des sujets sains avec une réaction à la tuberculine avec du sérum provenant de patients atteints de tuberculose a inhibé la production d’IFN-γ en réponse à M. tuberculosis, et l’inhibition a été bloquée par anti-IL- Ainsi, les concentrations sériques d’IFN-γ, et IL- ne coïncident pas avec les taux de cytokine induits par M tuberculosis et avec l’augmentation des taux sériques d’IL chez les patients s avec tuberculose inhibent la production d’IFN-γ en réponse à des antigènes mycobactériens

L’IFN-γ joue un rôle fondamental dans la réponse immunitaire à la tuberculose Les souris avec une délétion ciblée du gène IFN-γ sont très sensibles à la tuberculose , et les patients avec des récepteurs défectueux pour IFN-γ ou IL- sont très sensibles aux infections mycobactériennes La production d’IFN-γ en réponse à l’infection à Mycobacterium tuberculosis est influencée par les monokines IL- et IL- , et les charges bactériennes chez les souris déficientes en IL sont plus importantes que chez les souris sauvages, ce qui suggère que Les études de la réponse systémique des cytokines chez les patients atteints de tuberculose se sont concentrées soit sur les taux sériques de cytokines, soit sur la production de cytokines par les PBMC. Ces études ont donné des résultats contradictoires. la production d’IFN-γ et d’IL- est réduite chez les patients atteints de tuberculose par rapport aux résultats chez les personnes en bonne santé qui ont des réactions aux tests cutanés tuberculiniques ci-après En revanche, d’autres ont montré que les concentrations sériques d’IFN-γ et d’IL- sont augmentées chez les patients atteints de tuberculose par rapport aux personnes en bonne santé qui ont fourni des échantillons de sérum Pour résoudre ce paradoxe, nous avons étudié les deux concentrations de cytokines dans le sérum et la production de cytokine induite par la tuberculose par des PBMC provenant des mêmes personnes atteintes d’une infection à M tuberculosis

Matériaux et méthodes

Population de patients Des échantillons de sang ont été prélevés sur des répondeurs de TCT en bonne santé et sur des patients séronégatifs pour le VIH présentant une tuberculose confirmée par culture et ayant reçu un traitement antituberculeux pour & lt; Sept patients avaient une maladie pulmonaire modérément avancée, une maladie pulmonaire très avancée , et une lymphadénite tuberculeuse. Un consentement éclairé a été obtenu de tous les patients. Toutes les études impliquant des sujets humains ont été approuvées par le comité d’examen institutionnel du Centre de santé de l’Université du Texas à TylerIsolation. des PBMC et des conditions de culture cellulaire Les PBMC ont été isolées à partir d’échantillons sanguins par centrifugation différentielle sur Ficoll-Paque Pharmacia PBMC × ont été étalées dans des plaques à fond plat Becton Dickinson Labware dans μL de RPMI Life Technologies contenant de la pénicilline-streptomycine Life Technologies et sérum humain inactivé, en présence ou en l’absence de μg / mL de souche M tuberculosis Erdman tuée par la chaleur fournie par P Brennan, Colorado State University, Fort Collins Dans certaines expériences, × CMSP récupérées chez des répondeurs TST sains ont été cultivées en mL de RPMI contenant% pooled sérum obtenu de patients atteints de tuberculose ou de Des cellules saines ont été réensemencées en présence ou en l’absence de μg / mL de M tuberculosis tuée par la chaleur Erdman Dans certains cas, les PBMC ont été cultivées avec du sérum et des anticorps neutralisants contre IL-PharMingen Lorsque les échantillons de sang ont été obtenus, le sérum a été traité en min et stocké à – ° C. Pour la mesure des taux de cytokines, les surnageants des PBMC cultivées ont été collectés après plusieurs jours et conservés à – ° C. C Les surnageants de sérum et de culture ont été décongelés et les niveaux de cytokine ont été mesurés par ELISA Des anticorps appariés ont été utilisés pour détecter les kits IFN-γ, IL-PharMingen et IL-R & D Systems ELISA pour mesurer les niveaux de IL-MBL International. et IL-p R & D Les limites inférieures de détection pour les tests ELISA étaient pg / mL pour IL-, pg / mL pour IFN-y, pg / mL pour IL-, pg / mL pour IL- et pg / mL pour IL- Cytok Les résultats sont présentés sous forme de moyenne ± SE Pour les données qui étaient normalement distribuées, des comparaisons entre les groupes ont été effectuées. fait avec un test t de Student apparié ou non apparié, selon le cas Pour les données qui n’étaient pas distribuées normalement, le test de la somme des rangs de Wilcoxon a été utilisé P & lt; a été considéré comme statistiquement significatif

Résultats

IFN-γ dans le sérum et dans les surnageants de PBMC stimulées par la tuberculose Les taux sériques d’IFN-γ ont été plus élevés chez les patients atteints de tuberculose qu’ils ne l’étaient chez les répondeurs TST en bonne santé ± pg / mL vs ± pg / mL; P =; Figure A PBMC de ces patients atteints de tuberculose et des répondeurs TST en bonne santé ont été cultivés avec M tuberculosis tué par la chaleur pendant plusieurs jours Les taux moyens d’IFN-γ dans M cultures stimulées par tuberculose pour les patients atteints de tuberculose étaient moins d’un tiers des valeurs correspondantes pour les répondeurs de TST en bonne santé ± pg / mL vs ± pg / mL; P & lt;

Figure View largeTéléchargement de concentrés d’IFN-γ A, IL-B et IL-C dans le sérum et dans les surnageants de PBMC stimulées par Mycobacterium tuberculosis Des échantillons de sérum ont été prélevés chez des tuberculeux tuberculeux et chez des personnes saines ayant des réactions tuberculiniques. des patients atteints de tuberculose et de personnes atteintes de PPD en bonne santé ont été cultivés en présence de M. tuberculosis, et les surnageants ont été recueillis après des jours pour mesurer les niveaux d’IFN-γ, IL- et IL- par ELISA. -γ A, IL-B et IL-C dans le sérum et dans les surnageants de PBMC stimulées par Mycobacterium tuberculosis Des échantillons de sérum ont été prélevés chez des patients atteints de tuberculose tuberculeuse et chez des personnes saines ayant des réactions aux tests tuberculiniques. des personnes PPD en bonne santé ont été cultivées en présence de M. tuberculosis, et les surnageants ont été recueillis après des jours pour la mesure des niveaux de IFN- , IL- et IL- par ELISA Les données sont des concentrations SEC moyennes de monokines qui favorisent une réponse de type I. La production d’IFN-γ par les lymphocytes T dépend des effets synergiques des monokines IL- et IL- IL- peuvent également contribuer à La production d’IFN-γ par les cellules tueuses naturelles et les cellules T CD en réponse aux mycobactéries Les concentrations d’IL- étaient similaires dans les échantillons sériques obtenus chez les patients atteints de tuberculose et les répondeurs TST sains ± pg / mL vs ± pg / mL; Figure B Cependant, les concentrations moyennes d’IL- dans les cultures de PBMC stimulées par la tuberculose provenant de patients atteints de tuberculose étaient inférieures à un tiers des valeurs correspondantes pour les répondeurs de TST en bonne santé ± pg / mL vs ± pg / mL; Les taux d’IL-p sérique chez les patients atteints de tuberculose étaient similaires à ceux observés chez les répondeurs TST sains, et IL- n’a pas été détecté dans les surnageants de culture de PBMC stimulées par M tuberculosis provenant des deux groupes: Sérum IL- et M tuberculosis-stimulé. Nous avons ensuite étudié la production de IL-, qui supprime la réponse cytokinique de type à la tuberculose et aux autres mycobactéries. Les taux sériques moyens d’IL- ont été élevés chez les patients atteints de tuberculose par rapport aux taux chez les répondeurs de TST en bonne santé ± pg / mL vs ± pg / mL; P & lt ;; Figure C Cependant, la production d’IL induite par la tuberculose par les PBMC récupérées chez les patients atteints de tuberculose était similaire à la production par les PBMC de répondeurs TST sains ± pg / mL vs ± pg / mL; P = Effet du sérum obtenu chez des patients tuberculeux sur la production d’IFN-γ Nous avons émis l’hypothèse que, chez les patients tuberculeux, des taux sériques élevés de production d’IFN-γ diminuée en IL par des PBMC cultivées avec M tuberculosis in vitro. Des cellules de contrôle ont été cultivées avec du sérum inactivé à la chaleur provenant de donneurs sains à réaction tuberculinique négative Après h, les PBMC ont été lavées et stimulées à la chaleur -milled tuberculosis M pendant des jours, et IFN-γ niveaux ont été mesurés dans les surnageants Sérum des patients atteints de tuberculose inhibé de manière significative la production d’IFN-γ ± pg / mL vs ± pg / mL; P =; En revanche, le sérum provenant de répondeurs TST en bonne santé n’inhibe pas la production d’IFN-γ L’addition d’anti-IL- au sérum de tuberculeux rétablit la production d’IFN-γ induite par la tuberculose, mais l’incubation de PBMC avec anti-IL seul n’affecte pas la production d’IFN-γ Cela suggère que des taux sériques élevés d’IL chez les patients atteints de tuberculose inhibent les PBMC de production d’IFN-γ induites par M tuberculosis chez des patients atteints de tuberculose, produisant un taux moyen d’IFN-γ de pg / mL en incubation avec du sérum autologue, mais cette valeur a augmenté à pg / mL après incubation avec du sérum de répondeurs TST en bonne santé

Figure View largeTéléchargement de sérum de patients atteints de tuberculose et d’anticorps anti-IL sur la production d’IFN-γ: les PBMC de personnes saines ayant des réactions aux tests tuberculiniques ont été incubées avec du sérum% inactivé par la chaleur provenant de sérums de contrôle tuberculiniques sains,% sérum regroupé de personnes saines ayant réagi à la tuberculine sérum PPD,% sérum poolé de patients tuberculeux sérum TB, sérum TB et anti-IL-, ou anti-IL- et sérum témoin Après h, les PBMC ont été lavées fois et cultivées en présence de Mycobacterium tuberculosis pendant des jours, et les surnageants ont été recueillis pour la mesure des niveaux d’IFN-γ par ELISA Les données sont moyennes SE * P = comparées avec le sérum de contrôle; P = par rapport au sérum des sujets PPD; P = comparé à TBS et anti-IL-Figure View largeTélécharger la lameEffet du sérum poolé de patients atteints de tuberculose et anticorps anti-IL sur production d’IFN-γ: Les PBMC de personnes saines ayant des réactions aux tests tuberculiniques ont été incubées avec% sérum inactivé par la chaleur des sérums contrôlés tuberculiniques sains, sérum poolé% des sujets sains réagissant au sérum tuberculinique PPD, sérum poolé% des patients tuberculeux sérum TB, sérum TB et anti-IL- ou anti-IL- et sérum témoin , Les PBMC ont été lavées et cultivées en présence de Mycobacterium tuberculosis pendant des jours, et les surnageants ont été recueillis pour la mesure des taux d’IFN-y par ELISA. Les données sont des moyennes SE * P = comparées au sérum témoin; P = par rapport au sérum des sujets PPD; P = par rapport au TBS et anti-IL-

Discussion

L’addition de sérum provenant de patients atteints de tuberculose aux PBMC récupérées à partir de répondeurs de TST en bonne santé a inhibé leur capacité à produire de l’IFN-γ en réponse à M. tuberculosis, et cette inhibition a été plus faible. Ces résultats démontrent que les taux de cytokines sériques ne sont pas parallèles à la production de cytokines induite par la tuberculose par les PBMC et que les taux sériques élevés d’IL chez les patients atteints de tuberculose inhibent la production d’IFN-γ induite par la tuberculoseBien que de nombreux chercheurs aient évalué la cytokine Les résultats confirment que les taux sériques d’IFN-γ et d’IL- sont anormalement élevés chez les patients atteints de tuberculose, alors que les concentrations sériques d’IL- sont normales [,, ] Nous avons constaté que les taux sériques d’IL- et d’IL- n’étaient pas élevés chez les patients atteints de tuberculose. En revanche, Yamada et al ont trouvé que Cette différence peut être due à une diminution rapide des taux sériques de cytokines pendant le traitement antituberculeux Yamada et al ont étudié des patients atteints de tuberculose avant qu’ils ne reçoivent un traitement, alors que nous avons évalué patients traités pendant plusieurs semaines Chez les patients tuberculeux non traités, les taux sériques moyens d’IL- sont seulement plus élevés que chez les sujets sains , alors que les concentrations moyennes sériques d’IFN-γ et d’IL- sont plus élevées que Chez les sujets sains, les taux de cytokine sérique diminuent pendant la thérapie antituberculeuse , les concentrations sériques d’IL- relativement faibles peuvent diminuer dans la plage normale au cours des premières semaines de traitement antituberculeux, alors que les taux d’IFN-γ et d’IL- restent anormaux. La discordance entre les taux sériques de cytokines et la production de cytokines induite par M. tuberculosis par les PBMC suggère que les cytokines sériques concen Les taux sériques élevés d’IFN-γ et d’IL- chez les patients atteints de tuberculose sont dus à la fuite de ces cytokines des tissus dans la circulation, car les lymphocytes T et les macrophages sur le site de la maladie La perméabilité vasculaire locale est susceptible de favoriser la diffusion des cytokines dans la circulation sanguine. De plus, les concentrations sériques moyennes d’IFN-γ et d’IL- sont plus élevées chez les patients atteints de tuberculose et chez les patients atteints de tuberculose. Enfin, la diminution des taux sériques d’IFN-γ et d’IL- en tant qu’inflammation tissulaire se résout au cours de la thérapie. Il est également possible d’observer la réponse inflammatoire locale la plus sévère et la production de cytokines. En accord avec cette hypothèse, les phagocytes mononucléaires jouent un rôle central dans la présentation de l’antigène et dans la production d’IFN-γ par les cellules T lorsqu’elles sont exposées à M tuberculosis, Les cellules présentatrices de ntigène produisent IL- et IL-, qui se lient à leurs récepteurs respectifs et induisent la production d’IFN-γ IL- régule également l’expression de la chaîne α du récepteur IL , entraînant des effets synergiques de ces cytokines sur la production d’IFN-γ Nous avons trouvé que le sérum des patients atteints de tuberculose inhibait la capacité des PBMC provenant de répondeurs TST sains à produire l’IFN-γ en réponse aux antigènes M tuberculosis. Cette inhibition a été inversée par neutralisation des IL-, suggérant que la capacité réduite des PBMC chez les patients atteints de tuberculose pour produire l’IFN-γ en réponse à M la tuberculose est due en partie à l’exposition à des concentrations élevées d’IL- in vivo IL- peut inhiber la production d’IFN-γ par les cellules T par inhibition transcriptionnelle de la production d’IL-p par les monocytes Cependant, les monocytes et PBMC stimulés par M tuberculosis chez les patients atteints de tuberculose ont produit des quantités normales d’IL- dans la présente étude et dans des études antérieures Bien que les taux élevés d’IL sérique ne soient pas réduits Cette hypothèse est corroborée par des travaux antérieurs démontrant que l’IL- régule à la baisse l’expression des chaînes β et β du récepteur IL et que les cellules T des patients sont inhibées par les PBMC des patients atteints de tuberculose. L’IL- inhibe également l’expression de l’IL-ARNm , et nous supposons que les taux sériques élevés d’IL diminuent la production d’IL induite par la tuberculose par les PBMC provenant de patients atteints de tuberculose, contribuant ainsi à réduire l’IFN-. En résumé, nous avons démontré que les concentrations de cytokine sérique chez les patients tuberculeux ne sont pas parallèles à celles des PBMC fatigue. La production de cytokines induite par la tuberculose par les PBMCs est élevée chez les patients atteints de tuberculose. régulation de l’expression des récepteurs IL- et inhibition de la production d’IL- Des études complémentaires sont nécessaires pour comprendre les interactions complexes des cytokines dans réponse immunitaire humaine à la tuberculose