Pneumonie Pneumococcique Bactérienne Acquise par la Communauté chez les Enfants: Diagnostic et Sérotypage par Réaction en Chaîne de Polymérase en Temps Réel à l’aide d’Echantillons sanguins

Contexte Le but de cette étude était d’utiliser la RT-PCR en temps réel sur des échantillons de sang pour diagnostiquer et sérotyper une infection pneumococcique chez une grande cohorte d’enfants italiens hospitalisés pour une pneumonie acquise en milieu communautaire. Nous avons mené une étude observationnelle d’avril à juin. – années avec un diagnostic de pneumonie communautaire admis dans les hôpitaux pédiatriques en ItalieRésultats Sept cent cinquante-et-un enfants ont été étudiés RT-PCR a trouvé une infection pneumococcique chez% des patients Chez les patients, culture et RT-PCR ont été réalisées simultanément Streptococcus pneumoniae des patients; % testé positif par RT-PCR et% testé positif par culture RT-PCR était significativement plus sensible que la culture en révélant l’odds ratio pneumonie bactériémique ,; % intervalle de confiance, -; P & lt; Une pneumonie compliquée a été retrouvée chez% des enfants; % d’entre eux avaient un épanchement parapneumonique, et% avaient empyème Les enfants atteints de pneumonie compliquée étaient significatifs plus âgés La bactériémie pneumococcique a été trouvée par RT-PCR se produire significativement plus fréquemment chez les enfants présentant des complications [%] que chez les enfants atteints de pneumonie non compliquée [%] ; odds ratio,; % intervalle de confiance, -; P & lt; La RT-PCR a permis le sérotypage du sang chez% des patients Plus des deux tiers des cas de pneumonie étaient dus à des sérotypes de vaccins conjugués non pneumococciques Le sérotype était le sérotype [%] le plus fréquent et était significativement associé aux complications% chez les patients atteints de pneumonie compliquée vs% chez les patients atteints de pneumonie non compliquée; odds ratio,,% intervalle de confiance, -; La RT-PCR permet le diagnostic et le sérotypage des pneumonies pneumococciques acquises dans la communauté chez les enfants et constitue un outil important pour évaluer la distribution des sérotypes dans des échantillons négatifs pour la culture.

Streptococcus pneumoniae est la cause la plus fréquente de pneumonie acquise dans la communauté chez les enfants et les adultes Les données disponibles sur l’incidence et la distribution du sérotype S pneumoniae circulant ont été obtenues par détermination sérologique du type capsulaire après culture ou par typage moléculaire des isolats Cependant, l’efficacité de ces méthodes est limitée en raison du besoin de croissance bactérienne, qui dépend à son tour d’une charge suffisante de bactéries viables dans les échantillons biologiques. Les enfants atteints de pneumonie présentent un faible risque de bactériémie ; En outre, l’utilisation d’un traitement antibiotique en ambulatoire au début d’un épisode fébrile réduit la sensibilité de la culture Les méthodes moléculaires appliquées sur des échantillons sanguins ou d’autres liquides organiques peuvent être efficaces pour le diagnostic et le sérotypage des pneumococcies invasives. Ces méthodes ne nécessitent pas de bactéries viables, ont besoin de petits volumes d’échantillons et semblent plus sensibles que les méthodes culturales; ils pourraient donc être un outil utile dans le diagnostic et le sérotypage de la pneumonie pneumococcique Le but de cette étude était de diagnostiquer et de sérotyper la pneumonie pneumococcique bactériémique en utilisant la RT-PCR en temps réel sur des échantillons de sang dans une large cohorte de Enfants italiens hospitalisés avec CAP et de comparer la sensibilité des méthodes moléculaires par rapport aux méthodes fondées sur la culture

Patients et méthodes

La pneumonie a été suspectée sur la base de signes cliniques, tels que la tachypnée et les bruits respiratoires anormaux, et a été confirmée par examen radiographique du thorax ou par tomodensitométrie En collaboration avec des radiologistes, un pneumologue pédiatrique expérimenté en radiologie qui ignorait les résultats cliniques et biologiques des radiographies évaluées par les patients et a attribué des diagnostics standardisés et mutuellement exclusifs incluant la consolidation focale, segmentaire ou lobaire avec ou sans épanchement pleural, la pneumonie interstitielle, l’atélectasie, ou pneumonie nécrosante La PAC compliquée a été définie comme la présence de ⩾ des suivants: un épanchement parapneumonique définit comme un fluiplement pleural localisé sur un radiogramme thoracique un échographie thoracique, ou une tomodensitométrie; tout paramètre flui pleural compatible avec l’empyème ; et / ou atélectasie ou pneumonie nécrosante Les enfants étaient considérés comme complètement vaccinés s’ils avaient complété le calendrier national de vaccination, y compris les doses du vaccin conjugué anti-pneumococcique conjugué-VPV- à, et des mois ou une dose unique après la vaccination. Première année de vie Les enfants étaient considérés comme incomplètement vaccinés s’ils avaient commencé mais pas terminé le calendrier des vaccinationsPatients et échantillons bleus Tous les patients âgés de – ans admis avec un diagnostic de pneumonie dans les centres participants pendant la période d’étude ont été inclus dans l’étude Les critères d’exclusion étaient les maladies concomitantes sévères, par exemple les maladies rénales, hépatiques ou cardiovasculaires, l’immunodépression, le syndrome de malabsorption ou la néoplasie et les infections nosocomiales. Pour exclure ces derniers, les enfants admis à l’hôpital ou ayant été évalués département d’urgence dans les jours précédents ont été exclus de l’étude le consentement éclairé écrit a été obt Aidé de tous les parents ou tuteurs L’étude a été approuvée par le comité d’examen institutionnel local. Du sang entier a été prélevé le plus tôt possible après l’admission à l’hôpital. Des échantillons pour la RT-PCR ont été obtenus auprès de tous les patients; Les cliniciens ont été autorisés à choisir quand demander des hémocultures. Pour des raisons de culture, des échantillons de sang ont été immédiatement envoyés au laboratoire local. Des procédures standardisées ont été utilisées pour la collecte et l’envoi d’échantillons de sang aux laboratoires locaux. envoyé à température ambiante au Laboratoire central Laboratoire d’immunologie, Hôpital universitaire pour enfants Anna Meyer, Florence, Italie, avec utilisation d’un transporteur rapide gratuit Les échantillons ont été livrés le jour suivant et les tests moléculaires ont été effectués en h après l’administration; mL de sang total non centrifugé a été utilisé pour le diagnostic et le sérotypage par RT-PCRDiagnostic de la pneumonie pneumococcique bactériémique Le diagnostic de pneumonie pneumococcique bactériémique confirmée en laboratoire a été réalisé en présence de culture positive pour S pneumoniae et / ou RT-PCR positive pour le gène lytA, comme décrit ailleurs La valeur CT du cycle de cycle est le nombre de cycles de PCR auquel le signal fluorescent mesuré dépasse un seuil de fond calculé, identifiant l’amplification de la séquence cible s’il n’y avait pas d’augmentation du signal fluorescent avant L’ADN pneumococcique n’a jamais été retrouvé dans le sang d’enfants en bonne santé, porteurs ou non porteurs de S pneumoniae [échantillon sanguin prélevé sur témoins sains appariés selon l’âge]. ] Analyse quantitative de l’ADN pneumococcique Pour quantifier la quantité d’ADN bactérien présent dans chaque échantillon, les normes ont été prépa rouge comme décrit ailleurs avec l’utilisation de suspensions de S pneumoniae dans une solution saline tamponnée au phosphate La quantité d’ADN bactérien a été obtenue par extrapolation directe des valeurs CT à la quantité d’ADN telle que lue à partir de la courbe standard. par RT-PCR Vingt et un jeux d’amorces / sondes ciblant différentes régions du gène CpsA spécifiques aux sérotypes ont été utilisés comme décrit ailleurs Si aucune augmentation du signal fluorescent n’a été observée avant le cycle th pour l’un des ensembles mais les deux RT-PCR et CpsA dans la PCR finale étaient positifs, l’échantillon a été rapporté comme sérotypes non-VPC, les sérotypes liés au VPC, ou les sérotypes non vaccinaux dont A ont été définis selon Hsu et al Analyse statistique Les données ont été traitées avec le progiciel statistique SPSSX SPSS; P & lt; Les résultats ont été exprimés sous forme de niveaux moyens et d’écarts-types ou de fourchettes médianes et interquartiles selon le cas. Le test a été utilisé pour évaluer les différences de groupe dans les variables catégorielles. variables continues, le test t de Student a été utilisé avec la transformation logarithmique de variables distribuées non normales

Résultats

Sept cent cinquante-et-un enfants atteints de pneumonie enfants de sexe masculin [%]; âge médian, années; intervalle interquartile, – années incluses dans l’étude; % étaient âgés & lt; années Les patients ont été recrutés dans les centres des régions italiennes. La seule région qui ne comprenait aucun patient représente% de la population italienne âgée de & lt; La pneumonie compliquée et non compliquée était présente chez les patients% La distribution des complications est donnée dans le tableau Les complications étaient significatives associées à un âge avancé, une consolidation lobaire, une augmentation du taux de protéine C-réactive et des numérations globulaires neutrophiles. table de traitement

Table View largeTéléchargement de diapositivesDémographiques et de caractéristiques de laboratoire selon le tableau de présence de complications View largeTéléchargement de diapositives Caractéristiques démographiques et de laboratoire selon la présence de complications Diagnostic de la pneumonie pneumococcique bactériémique par RT-PCR et / ou culture Tous les patients ont été testés; ont été testés par RT-PCR seul, et ont été testés à la fois par RT-PCR et culture Dans ce dernier groupe, S pneumoniae a été trouvé chez les enfants%; il a été identifié par RT-PCR chez les patients% et par culture chez les patients% Globalement, S pneumoniae n’a été identifié par RT-PCR qu’en% des patients, par culture seulement en% des patients, et par les deux tests en% des brevets RT- La PCR était significativement plus sensible que la culture dans la réalisation du diagnostic en laboratoire du rapport de cotes de pneumonie bactériémique; % CI, -; P & lt; , par χ test; K de Cohen; P & lt; , par le test de McNemar Le traitement antibiotique a été reçu avant l’hospitalisation par% des patients dont les conditions ont été diagnostiquées par les cultures et par% des patients diagnostiqués par RT-PCR P = L’âge moyen des patients positifs pour la culture ou RT-PCR Les cliniciens avaient tendance à demander des cultures dans les cas les plus sévères. En effet, les cliniciens ont demandé des tests de culture chez les patients atteints de pneumonie non compliquée% et chez les patients présentant une pneumonie compliquée% d’odds ratio ,; % CI, -; P = Le résultat de la RT-PCR était positif chez les patients% chez lesquels la culture et la RT-PCR étaient réalisées et chez les patients% chez lesquels la culture n’était pas pratiquée Globalement,% des patients avaient des résultats positifs pour S pneumoniae Parmi eux, Tableau En plus des échantillons trouvés positifs pour S pneumoniae par culture, parmi les cultures testées positives pour Staphylococcus epidermidis n = et Staphylococcus hominis n =; ils ont été signalés comme “contamination bactérienne” par le microbiologiste de laboratoire

Table View largeTélécharger slideClinical and Laboratory Caractéristiques des enfants selon l’âge & lt; ans vs – yearsTable Voir en grandDownloadableClinical and Laboratory Caractéristiques des enfants selon l’âge & lt; Les caractéristiques démographiques, cliniques et de laboratoire des enfants selon la bactériémie pneumococcique par RT-PCR sont indiquées dans le tableau. Augmentation des niveaux de protéine C-réactive et / ou de numération des globules blancs et / ou La numération sanguine des neutrophiles était associée à des cas compliqués et à l’origine pneumococcique. La culture et la positivité à la RT-PCR étaient significativement associées aux complications. Tableau Analyse quantitative de l’ADN pneumococcique La charge bactérienne médiane était de 1/5. la charge bactérienne était significativement plus élevée chez les patients positifs à la culture médiane, copies de journal / mL [gamme, – copies de journal / mL] contre les copies log / mL [gamme, – copies de journal / mL]; % CI, -; P = et ont tendance à être plus élevé chez les patients âgés de ans Table; Tableau La valeur de CT variait entre et le sérotypage RT-PCR a permis le sérotypage en% de patients atteints de pneumonie bactériémique, y compris% de patients atteints de pneumonie compliquée et% de patients atteints de pneumonie non compliquée. Les sérotypes retrouvés chez les patients ayant des cultures positives sont les suivants: sérotype et isolats chacun et sérotypes, isolats A, V, C et A chacun. discordance a été trouvée entre le sérotypage moléculaire et cultureSerotype a été le plus fréquent [%] de, suivi par sérotypes A [%] de et [%] de sérotype était significativement associé à des complications [%] de patients atteints de pneumonie compliquée vs [%] de patients avec une pneumonie non compliquée; odds ratio,; % CI, -; Pp et âge moyen âge, années [extrêmes, – années] vs années [extrêmes, jours à années]; % CI, -; P = Le sérotype n’était présent que chez les enfants plus âgés et avait une fréquence de% chez les enfants plus jeunes. années, la distribution des sérotypes pneumococciques était plus homogène, avec des fréquences allant de% de sérotypes, et à% de sérotypes A et F Le sérotype A était significativement associé à un âge médian plus jeune, des années; tranche d’âge, mois à années; vs âge médian, années; tranche d’âge, mois à années pour les sérotypes non-A; % CI, -; P = Statut vaccinal Deux cent soixante dix pour cent des patients ont été complètement vaccinés,% non vaccinés et% incomplètement vaccinés Les données concernant la vaccination n’étaient pas disponibles pour% des enfants Parmi les enfants avec S pneumoniae sérotypés via des méthodes moléculaires, vaccinés, vaccinés incomplètement et n’étaient pas vaccinées Les données n’étaient pas disponibles pour la pneumonie due aux sérotypes du PCV ou aux sérotypes de sérotypes liés au PCV; % a été trouvé seulement dans le groupe des enfants non vaccinés Aucune différence dans le taux de pneumonie compliquée était présente parmi les groupes; des complications ont été observées chez les patients non vaccinés, et des complications ont été observées chez les enfants P = totalement ou partiellement vaccinés

Discussion

l’analyse quantitative a démontré, comme prévu, que la charge bactérienne est significativement plus élevée chez les patients positifs pour la culture et tend à être plus élevée chez les enfants plus âgés. Au contraire, aucune différence de charge bactérienne n’a été observée entre les patients atteints de pneumonie compliquée et non compliquée. Il peut être suggéré que des facteurs autres que la charge bactérienne, en fonction de l’agressivité du sérotype ou de la réponse de l’hôte, sont plus importants. Les données obtenues par sérotypage directement à partir d’échantillons sanguins ont obtenu des résultats cohérents avec ceux obtenus par sérotypage d’isolats dans les pays occidentaux Le sérotype est apparu significativement associé aux complications et à l’âge avancé Le rôle important du sérotype dans tous les cas de pneumonie et surtout je Des complications ont été suggérées par d’autres rapports [, -]; les données actuelles montrent pour la première fois qu’en Italie le sérotype seul cause actuellement plus d’un tiers des cas de pneumonie pneumococcique bactériémique et% de cas compliqués. La prévalence du sérotype A est de%, avec une prévalence significativement plus élevée chez les jeunes enfants. qui représente l’un des sérotypes les plus fréquents en Italie au cours de la dernière décennie a maintenant une prévalence de <%> Un changement vers des sérotypes non vaccinaux a été décrit après la vaccination de masse et est associé à une diminution du nombre de cas dus aux sérotypes vaccinaux Ce n’est pas le cas en Italie, où la vaccination est limitée à certaines régions, couvrant globalement <% du pays. Il est donc improbable qu'un changement attribuable à la vaccination par le PCV soit la seule cause du sérotype et Une augmentation Une augmentation spontanée de la fréquence des sérotypes, comme démontré à l'époque de la prévaccination en Belgique et la tendance séculaire démontrée pour différents sérotypes aux États-Unis [ ,], peut probablement contribuer au phénomène observé en Italie Les sérotypes de PCV n'ont jamais été trouvés chez des enfants totalement ou partiellement vaccinés Cependant, actuellement, des vaccins autres que pCV- sont nécessaires en Italie En fait,% de tous les cas de pneumonie et% des cas compliqués sont dus à des sérotypes qui ne sont pas inclus dans le PCV mais sont inclus dans la formulation actuelle. La présente étude a montré un pourcentage de PAC compliquée de & gt;%, cohérent avec les résultats obtenus dans d'autres pays occidentaux. de la PAC compliquée a semblé croître dans le monde [,,], augmentant de% à% aux Etats-Unis , et un rôle de sérotypes agressifs de S pneumoniae a été émis Nos données démontrent que la bactériémie pneumococcique était des fois plus fréquente dans la PAC compliquée et que le sérotype est prévalent Ces résultats sont confirmés par l'analyse séparée sur les patients du groupe des enfants plus jeunes âgés de & lt; années, ce qui a montré que même si le taux de pneumonie pneumococcique bactériémique est similaire à celui des enfants plus âgés, le taux de complication est plus faible. Ceci est probablement dû à la fréquence élevée de serotypes pneumococciques plus agressifs chez les enfants plus âgés, tels que le sérotype. jamais trouvé chez les enfants âgés de & lt; Une autre étude a suggéré qu'une expansion d'un clone de prévaccination plus que de nouveaux clones est responsable de la diffusion de PAC compliquée due au sérotype. Le séquençage de l'ADN bactérien des cas dus au sérotype est maintenant en cours dans notre laboratoire pour évaluer si une condition similaire est Présent en ItaliePour les causes de la PAC, S pneumoniae, bien que vraisemblablement la cause bactérienne la plus fréquente, reste encore sous-estimée car la PAC pneumococcique non bactérienne est probablement la cause dans la plupart des cas Des biomarqueurs de substitution ont été étudiés, mais la recherche d'anticorps spécifiques Les antigènes urinaires ont souvent donné des résultats frustrants Même si la RT-PCR sur des prélèvements sanguins ne permet pas d'identifier toutes les pneumonies pneumococciques, elle est sans doute un outil important pour obtenir un suivi fiable des sérotypes circulants. de la haute sensibilité de cette méthode, en utilisant le sérotypage moléculaire directement sur l'échantillon de sang En effet, étant donné la fréquence des résultats positifs de la culture démontrés dans la présente étude, une population de patients atteints de pneumonie aurait probablement été nécessaire pour obtenir des cas positifs avec la culture basée sur la pneumonie. méthodes La RT-PCR est simple et connue pour être moins coûteuse que les méthodes basées sur la culture En ce qui concerne la PCR séquentielle multiplexe, elle pourrait aussi être une amélioration pour les pays en voie de développement où les méthodes moléculaires ont démontré une sensibilité significativement supérieure à celle des méthodes basées sur la culture

Groupe italien pour l’étude des pneumococcies invasives

Agostiniani R, Pistoia; Allievi P, Garbagnate Milanese; Allù G, Ragusa; Amigoni A, Ravenne; Baldo E, Rovereto; Barlocco G, Grosseto; Bernardi P, Bologne; Bernardini R, Empoli; Biban p, Borgotrento; Bossi G, Pavie; Bottone U, Massa; Cardinale A, Montevarchi; Cardona A, Foligno; Castelli Gattinara G, Roma; Celandroni A, Pontedera; Chiossi M, Cuneo; Colleselli P, Vicenza; Correra A, Napoli; D’Ascola G, Arezzo; D’Aquino A; Udine; Dollfus L, Terni; Domenici R, Lucca; Flacco V, Furbetta M, Pérouse; Gaetti MT, Jesi; Gagliardi L, Viareggio; Ghiori F, Firenze; Giani I, Montepulciano; Giglio P, Gubbio; Guala A, Verbania; Icardi G, Gênes; Lanciano; Lanari M, Imola; Lippi F, Firenze; Lizzoli C, Magenta; Lombardi E, Firenze; Macchia PA, Pise; Magnini M, Esine; Memmini G, Carrara; Mesirca P, Montebelluna; Micheletti E, Livourne; Migliozzi L, Senigallia; Nunziata F, Aversa; Osimani P, Ancône; Paravati D, Crotone; Pecile P, Udine; Pepe G, Gallipoli; Peris A, Firenze; Perri PF, Macerata; Pescollderungg L, Bolzano; Pezzati M, Firenze; Poggi GM, Firenze; Poggiolesi C, Firenze; Prato R, Foggia; Principi N, Milan; Rapisardi G, Firenze; Ridi F, Firenze; Riva A, Brescia; Rizzo L, Portoferraio; Roman B, Vimercate; Toffolo A, Oderzo; Strano M, Borgo San Lorenzo; Trapani S, Firenze; Vasarri P, Prato; Vascotto M, Sienne; Vecchi V, Rimini; Ventura A, Trieste; Verini M, Chieti; Zorzi C, Camposanpiero

Remerciements

Nous sommes sincèrement reconnaissants à Giancarlo Perferi et à Claudia Valleriani pour leur soutien technique. Soutien financier La recherche a été partiellement soutenue par le Département italien de la Santé, le Centre italien de prévention et de contrôle des maladies – Tous les auteurs: no confl cts