Prédisposition virale et charge virale d’Epstein-Barr dans une grande cohorte de receveurs allogéniques de cellules souches

Contexte Nous voulions déterminer la signification clinique et la prévisibilité des infections par le virus Epstein-Barr EBV parmi une large cohorte de receveurs de greffe de cellules souches allogéniques, non sélectionnées. Méthodes -, un total d’échantillons de sérum consécutifs obtenus lors de transplantations effectuées à Helsinki, Finlande, rétrospectivement analysé par amplification en chaîne par polymérase quantitative pour la présence d’EBAR DNAResults Dans l’ensemble, l’ADN EBV a été noté dans au moins un échantillon de sérum pour les patients%, dont% présentaient une augmentation progressive et, finalement, des taux d’ADN EBV En outre, les patients% avaient de faibles niveaux d’ADN EBV niveau médian, copies / ml dans les sérums isolés avant la mort Parmi les receveurs de transplantés qui ont survécu, EBV transitoire ADNémie niveau médian, copies / mL, qui correspondait apparemment à une infection asymptomatique EBV , a été noté chez les patients% Conclusions La faible positivité de l’ADN de l’EBV dans le sérum survient relativement Cependant, des niveaux élevés d’ADN d’EBV, c’est-à-dire des copies / mL, sont de bons prédicteurs du développement d’une maladie lymphoproliférative post-transplantation, ne sont pas spontanément réversibles et doivent être traités immédiatement levitra generique. ⩾, copies / mL, le patient peut être classé comme ayant une infection EBV potentiellement mortelle

La maladie lymphoproliférative post-transplantation PTLD comprend un large spectre de troubles qui compliquent les conditions immunosuppressives de diverses formes Dans le contexte de la transplantation de cellules souches allogéniques non compliquées SCT, PTLD a été considéré comme une incidence rare, ⩽%; Cependant, parce que les facteurs de risque sont associés à une immunosuppression sévère, des taux plus élevés peuvent être rencontrés [,,, -] Facteurs de risque, tels que la disparité HLA, l’épuisement des cellules T greffées, la maladie du greffon contre l’hôte GVHD et l’administration de globuline antithymocytaire , peut augmenter le risque jusqu’à% -% [, ,, -] La plupart des cas de PTLD sont observés pendant les premiers mois après la SCT Le diagnostic précoce de PTLD est difficile PCR quantitative qPCR pour la détection de l’ADN EBV a été développé au cours des dernières Au début d’un diagnostic – même avant l’apparition des symptômes – la maladie peut être traitée rapidement ou de façon préventive [,,] En outre, l’efficacité du traitement PTLD peut être suivi par qPCR [, ,, -] Le but de la présente étude était d’évaluer la valeur diagnostique de la qPCR en temps réel en testant des échantillons de sérum pour l’infection EBV et en examinant le développement de PTLD associé à EBV

Matériaux et méthodes

Patients Pendant -, un total de patients adultes avaient subi un SCT allogénique à l’hôpital central de l’Université d’Helsinki. Un total d’échantillons de sérum ont été prélevés chez ces patients, – échantillons par patient La raison de la transplantation était une maladie hématologique maligne pour les patients et une les donneurs étaient frères et sœurs et n’étaient pas apparentés Tous les donneurs étaient HLA-A, HLA-B et HLA-DR appariés Des greffes, étaient de la moelle osseuse et étaient des cellules souches sanguines Les greffes étaient non manipulées Les données cliniques et de transplantation pour les patients ont été décrits en détail par Juvonen et al Hybridation in situ par EBV Pour détecter EBV dans les cellules malignes, les tissus tumoraux ont été examinés par hybridation in situ pour l’ARN codé EBV EBER et EBER [,, -] sections de paraffine fixe du les tissus malins ont été perméabilisés avec la protéinase K L’hybridation in situ a été réalisée en utilisant une sonde d’acide nucléique peptidique marquée par fluorescence complémentaire de EBER et EBER Dako et analysé à l’aide d’un automate Ventana ES Ventana Medical Systems La sonde a été visualisée avec un anticorps anti-fluorescéine Boehringer Mannheim et un kit de détection Ventana DAB. Ventana Medical Systems L’hématoxyline a été utilisée comme contre-colorant Pour confirmer la conservation de l’ARN, échantillons ont été dosés avec une sonde d’acide nucléique peptide positif de contrôle Dako dirigée contre ARN glycéraldéhyde-phosphate déshydrogénase Une sonde d’acide nucléique peptidique aléatoire Dako a été utilisée comme témoin négatifEBV qPCR Le test EBV qPCR que nous avons utilisé a été décrit ailleurs par Aalto et al. bref, l’ADN a été purifié à partir d’une aliquote de sérum -μL par digestion à la protéinase K mg / ml en mmol / L tampon Tris [pH,] contenant mmol / L NaCl, mmol / L EDTA, et% SDS pendant une nuit à ° C, suivi de extraction au phénol-chloroforme et précipitation à l’éthanol L’ADN purifié a été dilué en μL, dont μL a été utilisé comme matrice qPCR Les amorces amplifiant une séquence conservée d’ADN viral La sonde a été synthétisée par PE Applied Biosystems Foster City, CA Cinq microlitres d’ADN purifié ont été ajoutés à un mélange PCR contenant du TaqMan Universal PCR Master Mix Après avoir subi des temps de réaction de min à ° C pour l’activité de l’enzyme AmpErase UNG et min à ° C pour l’activation de l’ADN polymérase AmpliTaq Gold, nous avons soumis le produit à des cycles de s à ° C. C et min à ° C dans un détecteur de séquence PE Applied BiosystemsLa fluorescence en temps réel a été mesurée et la valeur du cycle de seuil pour chaque échantillon a été calculée Pour chaque PCR, une courbe standard a été préparée par des dilutions logarithmiques séquentielles × Particules d’EBV, souche B- Advanced Biotechnologies Les dilutions correspondaient aux particules d’EBV par réaction. La courbe a été créée avec le logiciel ABI Sequence Detection System par tracer les valeurs du cycle seuil par rapport à la concentration d’ADN EBV connue La limite de détection pour la positivité de l’ADN était des copies par millilitre de sérum Tous les échantillons ont été testés en double et la valeur moyenne a été utilisée comme numéro d’ADN. contrôle de l’ADN, chaque essai comprenait plusieurs témoins négatifs et non-témoins, ainsi qu’un contrôle positif contenant l’ADN EBV d’un nombre de copies connu. Les échantillons de sérum ont été dosés rétrospectivement dans des pools de sérums séquentiels obtenus du même patient, si possible. Les résultats positifs ont été réexaminés. Les échantillons avec des résultats positifs ont été réexaminés. Avant le début de cette étude, nous avons soigneusement conçu l’approche qPCR à échantillon un grand nombre d’échantillons de sérum provenant de patients atteints de PTLD qui avaient un fichier d’ADN EBV données vel non montrées

Résultats

Au total, l’ADN de l’EBV était présent dans au moins un échantillon de sérum prélevé sur% des patients. Un total de% des échantillons étudiés était positif pour l’EBV DNATwenty-deux patients% avaient des niveaux élevés d’ADN EBV niveau médian, copies / ml. Le niveau d’ADN a augmenté progressivement, avec des niveaux de pointe peu avant le décès des patients ou était déjà élevé chez les premiers patients positifs pour l’EBV Dans le premier échantillon EBV positif pour tous les receveurs, le niveau d’ADN médian EBV était, copies / mL, – ,, copies / mL Les derniers échantillons EBV-négatifs et premiers EBV-positifs ont été obtenus avec une moyenne de jours écartés, – jours Le niveau médian d’EBV dans le dernier échantillon était de ,, copies / mL range,, – ,,, copies / ml; ces derniers échantillons ont été obtenus en moyenne quelques jours avant la mort, – jours avant la mort. L’ADN de l’EBV a été détecté en moyenne quelques jours après la transplantation, – jours après la transplantation et quelques jours avant la mort, – jours avant la mort. qui ont présenté une rechute de la malignité hématologique, l’ADN de l’EBV est apparu des mois après la transplantation et après que le patient ait subi une GVHD induite par perfusion de lymphocytes donneurs. Tous les patients sont décédés; le diagnostic d’EBV PTLD a été confirmé pour les cas par autopsie, qui a révélé des infiltrats disséminés de lymphocytes contenant EBER

Figure View largeTélécharger la lameLe taux d’ADN EBV du virus d’Epstein-Barr chez les patients atteints d’une infection EBV mortelle, en fonction de l’heure de la mort marquée par la Figure Voir grandDownload slideLes niveaux d’ADN EBV du virus Epstein-Barr chez les patients présentant une infection EBV mortelle D’autre part, des échantillons sériques prélevés chez des patients% ont révélé une positivité transitoire de l’ADN EBV. Au suivi, parmi ces patients, seul l’échantillon contenant l’ADN EBV était l’échantillon EBV positif initial, les patients EBV positifs, et avait des échantillons EBV-positifs L’ADN viral a été détecté pour la première fois quelques jours après la période de transplantation, – jours après la transplantation. Le niveau d’ADN EBV médian, copies / mL; intervalle, -, copies / mL est resté & lt ;, copies / mL chez tous les patients Au cours du suivi, aucun de ces patients n’a développé PTLD De ces patients, sont toujours vivantsEn outre, les patients% ont eu des résultats PCR positifs pour EBV avec un niveau médian de charge virale faible, copies / mL; gamme, -, copies / ml observable dans seulement ou échantillons avant décès patients ou dans le dernier échantillon patient disponible qui vivait table Ces échantillons terminaux ont été obtenus quelques jours après la période de transplantation, – jours après la transplantation et quelques jours avant la mort intervalle, – jours avant la mort Cinq de ces patients avaient PTLD histologiquement confirmé dans l’étude postmortem De ces patients, avaient PTLD diffuse; leurs derniers échantillons de sérum ont été obtenus plusieurs semaines ou mois avant le décès, des jours avant le décès; intervalle, – jours avant la mort, ce qui explique peut-être les niveaux d’ADN EBV relativement faibles dans ces échantillons. Le dernier niveau d’ADN de l’EBV de l’échantillon du cinquième patient, copies / mL avait été obtenu plusieurs jours avant le décès; l’autopsie a révélé que ce patient présentait une PTLT de forme localisée, ne touchant que la rate. Les autres patients étaient des patients GVH, d’autres patients, des rechutes des patients malins d’origine et des patients atteints d’une maladie veino-occlusive.

Tableau View largeTélécharger la lameFindings of Epstein-Barr virus PCR quantitative EBV pour les derniers échantillons de sérum obtenus à partir de patients avec une conclusion EBV-PCR bas niveau, par rapport au temps après la transplantationTable View largeDownload slideFindings du virus Epstein-Barr virus EBV quantitative pour la les derniers échantillons de sérum obtenus chez des patients avec un résultat EBV-PCR terminal bas, par rapport au temps après la transplantation Au total, les patients% n’avaient pas d’ADN EBV détectable dans les échantillons sériques Pendant le suivi, seuls ces patients avaient développé des PTLD. , au-delà de l’échantillonnage pour cette étude, après une grave GVHD induite par l’IDD

Discussion

relations avec les PTLD associés à l’EBV dans une grande cohorte de receveurs SCT allogéniques non sélectionnés Dans l’ensemble, les infections à EBV après SCT étaient relativement courantes; % de nos patients avaient un ADN EBV détectable dans au moins un échantillon de sérum; Cesaro et al ont rapporté une réactivation de l’infection à EBV déterminée par l’augmentation de la charge virale notée par qPCR en% des receveurs SCT allogéniques pédiatriques. Le taux plus élevé de positivité de l’ADN EBV dans cette étude peut avoir au moins : les patients étaient des enfants et des PBMC étaient utilisés pour des échantillons Le seul facteur de risque significativement associé à la réactivation de l’infection EBV était l’utilisation de globuline antithymocytaire Dans une étude antérieure, van Esser et al ont analysé des échantillons de plasma obtenus par qPCR. Dans cette étude, aucun des receveurs de SCT non manipulés n’a développé d’ADN EBV dans les PBMC provenant de% des receveurs de SCT allogéniques. L’ADN plasmatique de l’EBV a été détecté en% de les receveurs, qui présentaient également les charges virales cellulaires les plus élevées Au total, dans la présente étude rétrospective, les bénéficiaires de SCT% avaient des niveaux d’ADN EBV élevés, c’est-à-dire, & g t, copies / mL Les taux d’ADN EBV de ces patients ont augmenté progressivement, les pics étant survenus peu de temps avant la mort, ou étaient déjà élevés dans le premier échantillon de sérum EBV-positif. Le pronostic de ces patients était sinistre; Tous les cas étaient mortels De plus, les patients% n’avaient qu’une positivité transitoire de l’ADN EBV, dont le temps moyen était au cours des premiers mois après la transplantation. Les taux d’ADN EBV restaient significativement plus bas chez ces patients que chez ceux ayant une infection EBV fatale; Fait important, pour tous ces patients, l’EBV a disparu sans intervention clinique, et aucun n’a développé d’EBV PTLD pendant le suivi. Par conséquent, nos données démontrent que les faibles niveaux d’ADN de l’EBV chez les patients avaient un niveau d’ADN EBV modérément élevé. Les échantillons de sérum sont fréquents et peuvent se résorber spontanément. Il est intéressant de noter que les patients avaient un faible niveau d’ADN EBV niveau médian, copies / ml dans les derniers échantillons disponibles avant la mort. Chez ces patients, le diagnostic postmortem était PTLD. ces patients, il est important de noter que de ces derniers échantillons ont été obtenus plusieurs mois avant la manifestation de PTLD. Les autres patients avaient, dans leurs derniers échantillons, des niveaux d’ADN EBV modérément élevés, et des copies / mL dans des échantillons obtenus et des jours avant. la mort, respectivement autopsie a révélé que PTLD de ce dernier patient était de la forme localisée; en revanche, la PTLD était diffuse chez les autres patients. Par conséquent, la découverte de niveaux d’ADN EBV modérément élevés justifie un suivi très étroit pour surveiller les augmentations du niveau d’ADN EBV. Actuellement, aucun consensus n’existe quant à l’échantillon à utiliser pour EBV qPCR: PBMC, sang non fractionné, sérum ou plasma Clave et al ont utilisé qPCR pour étudier à la fois des échantillons cellulaires et plasmatiques obtenus à partir de receveurs allogéniques SCT L’ADN d’EBV a été noté en% des échantillons de PBMC et en% des échantillons plasmatiques. Dans notre étude, l’ADN de l’EBV est apparu dans le sérum chez tous les patients présentant une infection sévère à EBV. Niesters et al ont rapporté des taux plasmatiques d’EBV très élevés chez les patients avec un niveau moyen de PTLD, copies / mL, des niveaux modérément élevés chez les patients atteints de mononucléose infectieuse moyenne niveau, copies / mL, et de faibles niveaux chez les receveurs de transplantation sans niveau moyen PTLD, copies / mL Kullberg-Lindh et al utilisé l’analyse qPCR des échantillons de sérum obtenus Des taux d’ADN EBV significativement plus élevés chez les patients présentant une infection symptomatique primaire ont été observés chez des patients transplantés hépatiques pédiatriques et ont montré des taux moyens, copies / ml plus élevés que ceux avec une infection asymptomatique primaire niveau moyen, copies / mL En termes d’échantillonnage, les PBMC peuvent être difficiles à obtenir. Les patients cytopéniques et les échantillons de plasma ou de sérum peuvent être considérés comme des échantillons de choix dans les situations où les numérations cellulaires sont faibles. Ceci est souvent le cas lorsque la reconstitution immunitaire est retardée ou pendant l’administration d’anticorps anti-CD [,,] Le volume réel de sérum ou de plasma requis pour le test qPCR dans notre étude est faible. μLPour une meilleure prise en charge des PTLD associés à l’EBV, la disponibilité de normes de laboratoire universelles pour EBV qPCR est cruciale. Ces normes faciliteraient la corrélation entre les charges virales et la maladie. des résultats de qPCR et des lignes directrices de traitement entre les chercheurs et les cliniciens, et, en général, sont une condition préalable pour l’univers En conclusion, de faibles taux sériques d’ADN EBV surviennent relativement fréquemment après la SCT et peuvent disparaître sans traitement spécifique D’un autre côté, des niveaux élevés d’ADN EBV, c’est-à-dire, & gt ;, copies / mL sont diagnostiques de PTLD, ne sont pas spontanément réversibles, et justifient un traitement immédiat

Remerciements

Nous remercions le Dr Malcolm Richardson, pour les révisions linguistiques, et Lea Hedman, Sanna Ilvonen, et Teija Tekkala pour l’assistance technique. La Fondation finlandaise de recherche contre le cancer, la Société médicale de Finlande, le Fonds de recherche et d’éducation de l’hôpital central d’Helsinki. Technology Advancement Fund, et Maud Kuistila Memorial Foundation Conflits d’intérêts potentiels Tous les auteurs: no conflicts