Structure − Etudes d’activité sur les dérivés du glycooctapeptide du facteur antiprolifératif (APF)

Cystite interstitielle / syndrome de la vessie douloureuse (IC / PBS) est une maladie dévastatrice de la vessie qui est caractérisée par l’amincissement ou même oblitération focale de l’épithélium de la vessie. 1 − 3 Environ 1 million d’Américains souffrent d’IC ​​/ PBS, et il se produit 9 fois plus souvent chez les femmes que chez les hommes. une condition de la vessie ressemblant IC / PBS a été décrite pour la première fois il y a environ 200 ans, 2 la cause de cette maladie est restée inconnue. Cependant, l’urine d’environ 95% des patients IC / PBS qui remplissent les critères NIDDK modifiés pour IC4 contient un facteur antiprolifératif (APF) qui diminue puissamment la prolifération des cellules épithéliales de la vessie humaine in vitro5 et provoque des changements dans l’épithélium vésical normal également vu dans la biopsie vésicale des spécimens et / ou des cellules épithéliales de vessie explantées de patients IC / PBS (y compris des changements spécifiques dans l’expression du facteur de croissance, 6 augmentation de la perméabilité paracellulaire, et des aberrations dans l’expression de la protéine jonction serrée et la formation de jonction serrée). un glycopeptide court contenant du trisaccharide — ; relation d’activité (SAR) .18 Bien que la séquence peptidique est identique à un segment du sixième domaine transmembranaire de la protéine frizzled-8, 17,19 un récepteur Wand ligand, les détails de sa biosynthèse et mécanisme d’action chez les patients IC / PBS restent inconnus. Une avancée importante dans la compréhension du mécanisme de la fonction de l’APF était l’identification de la protéine 4 associée au cytosquelette (CKAP4 / ERGIC-63 / CLIMP-63) comme récepteur cellulaire de l’APF dans l’épithélium de la vessie20. (2), et as-APF8 (3) effet. Une analyse préliminaire de APF a montré que le trisaccharide n’est pas une exigence absolue en tant que APF natif désialylé ainsi que le dérivé synthétique asialo (as-APF, 2, Figure ​ Figure1) 1) maintenu pleine puissance; cependant, deux résidus de sucre proximaux sont nécessaires pour l’activité 17,18 (le peptide non glycosylé ainsi que les dérivés de monosaccharide -GalNAc sont tous les deux inactifs). Une étude SAR récente18 de la partie peptidique de l’APF a révélé certaines exigences en acides aminés pour le maintien de l’activité as-APF. Une plus grande compréhension de la DAS pour les dérivés actifs de l’APF permettra potentiellement une conception plus rationnelle des mimétiques / inhibiteurs de l’APF. Comme le dérivé à 8 résidus (comme-APF8, 3, Figure 1) était équipotent à as-APF , nous avons synthétisé plusieurs analogues d’as-APF8 et avons comparé qualitativement leurs structures d’activité et de solution, déterminées à partir de dichroïsmes circulaires (CD) et de spectroscopies RMN. Nous nous sommes principalement concentrés sur les substitutions d’acides aminés C-terminales, car nos données précédentes indiquaient que le motif C-terminal A-XXX était important pour l’activité et que les modifications de ce segment avaient tendance à avoir des effets négatifs sur l’activité (à quelques exceptions près). Au cours de la caractérisation structurale initiale et du travail subséquent de SAR18 sur l’APF, on a découvert que les composés 2 et 3 (Figure 1) étaient essentiellement équipotents dans les essais d’antiprolifération avec des cellules épithéliales vésicales normales; une troncature supplémentaire en un 7-mère a donné un composé complètement inactif. Sur la base de ces résultats, la puissance de chaque analogue as-APF8 décrit dans ce rapport a été comparée simultanément à celle de 2.Les procédures générales pour la synthèse des glycopeptides, leurs structures et les données d’activité sont décrites dans les Informations de Support (Tableau S1). En général, les acides aminés protégés par Fmoc ont été couplés en utilisant HATU et HOAt en présence de DIPEA dans de la NMP sèche. L’incorporation du résidu de valine en position 2 a été affectée par deux cycles de couplage (couplage double) dans la synthèse de tous les glycopeptides en raison de la plus faible réactivité du groupe prolylamino secondaire. Le couplage de Fmoc-Thr (Ac4Gal β 1-3Ac2GalNAc α -O) -OH (1,1 équiv) a été effectué sans aucune base ajoutée pour empêcher l’épimérisation. On a déterminé que tous les composés étaient purs à 95% par chromatographie liquide haute performance analytique (CLHP) et analyse par chromatographie liquide par ionisation par électronébulisation / spectrométrie de masse (LC / MS) (information de support). L’inhibition de l’incorporation de [3H] thymidine était utilisé pour évaluer l’activité antiproliférative.5 Les données d’activité pour les glycopeptides dérivés d’APF synthétiques décrits ici avec les composés précédemment préparés 1 “sont énumérés dans le tableau SI dans les informations de support. Nous étions conscients qu’un disaccharide était une exigence pour l’activité antiproliférative du glycopeptide as-APF; 17,18 le peptide non glycosylé 5 était également dépourvu d’activité.Un ensemble représentatif de courbes de dosage pour les composés 2, 7, 9 et 14 est représenté sur la figure 22. Figure 2 Activité antiproliférative des composés 2, 7, 9 et 14 dans des cultures d’explants de cellules épithéliales de vessie normales. Les cellules épithéliales vésicales normales explantées ont été traitées avec des concentrations variables d’as-APF 2 (⧫), d’analogue de trileucine 7 (●), … Les modifications apportées aux trois acides aminés C-terminaux étaient soit # x0201c; single ” (composés 6, 13 et 14) ou “ global ” impliquant les trois acides aminés C-terminaux (composés 7 𢈒 12). Il a été précédemment déterminé que l’ionisation à l’extrémité C- ou N-amino-acide de l’as-APF était importante pour la pleine puissance comme “ le coiffage terminal ” Ce comportement était encore plus dramatique pour les dérivés de l’as-APF8, car l’analogue carboxamide C-terminal 6 était complètement inactif (l’acétylation du groupe amino N-terminal entraînait également une baisse de la puissance de 2,5 Nm). dans l’inactivation, données non représentées). Les composés 7 − 12 ont été préparés pour évaluer l’importance de l’hydrophobicité et du ramification de β dans le motif A-XXX de l’APF. Des données antérieures ont montré que cette unité pourrait permettre à la queue C-terminale d’analogues actifs de l’APF de remplir une forme de structure secondaire définie.18,21 Comme AS-APF8 maintenait une activité antiproliférative complète, nous avons systématiquement testé des analogues d’APF8 incorporant des acides aminés hydrophobes, en changeant globalement le segment de trivaline en un avec des acides aminés avec un motif méthylène ajouté (remplacement de la trileucine, désigné Leu6) par un avec des acides aminés n’ayant pas de chaînes latérales carbonées (Gly6) composé 10). Les valeurs du coefficient de partage octanol / eau (logP) de chaque nouveau composé ont été calculées22 et sont énumérées dans le tableau S1 de l’information justificative pour être comparées à as-APF8. L’analogue de Leu6 légèrement plus hydrophobe 7 a conservé un degré élevé d’activité (10% de l’activité complète), tandis que l’élimination d’un groupe méthyle des valines 6 par substitution avec de l’acide aminobutyrique non naturel (Abu, 8) en inactivation. Le dérivé d’Ala6 + 8, encore moins hydrophobe, donne un composé qui conserve toute son activité. Cela contraste avec le remplacement des valines dans l’APF 9-mère avec des alanines, car ce congénère a montré une réduction de la puissance de 2 ordres de grandeur par rapport à l’as-APF.18. il est difficile de rationaliser l’absence de l’activité de l’analogue 8GalNAc-O-TVPAA-Abu-Abu-Abu 8, car sa chaîne latérale éthyle est “ l’alanine et la valine à la fois dans l’hydrophobicité et dans la masse stérique. Lyu et al.23 ont trouvé que l’alanine et Abu possédaient une capacité égale (mais supérieure à la valine) pour stabiliser le contenu hélicoïdal. En supposant que la stabilisation du contenu hélicoïdal est également importante dans le C-terminal de l’APF, il semblerait raisonnable de prédire que 8 devrait montrer une certaine puissance dans notre dosage. Cependant, d’autres facteurs peuvent compliquer cette hypothèse (voir ci-dessous). Comme prévu, le composé 10 (substitution Gly6 𢈒 8) a entraîné une perte totale d’activité. La puissance a été partiellement récupérée (0,1%) lorsque Val6 𝵤 8 a été remplacé par β -alanine (composé 11), un remplacement utilisé dans de nombreux cas pour induire un contenu hélicoïdal dans de petits peptides24. Ajout d’un α le groupe méthyle par l’intermédiaire des remplacements de 3-homoalanine (composé 12) a encore une fois inactivé les glycopeptides. Deux substituts uniques utilisés précédemment dans l’as-APF ont également été utilisés dans l’as-APF8, à savoir. remplacement de Val7 par de la d-valine ou de l’alanine. Comme pour l’as-APF, la substitution d-valine inactivée sous la forme de -APF8, illustrant que les dérivés d’acides aminés non naturels (composés 8, 12 et 13) ne sont pas tolérés. L’analogue 14 unique substitué par Ala7 a également été préparé pour offrir un composé avec un logP qui était à mi-chemin entre les deux dérivés actifs 3 et 9. Cependant, cela a également entraîné une inactivation complète de la spectroscopie as- APF8.CD a été initialement utilisé pour étudier chaque analogique avec des comparaisons aux spectres pour 2 et / ou 3. Le spectre CD de 3 n’a révélé aucune structure organisée du glycopeptide dans l’eau (similaire aux données précédentes pour 2 (18)), comme c’était le cas pour tous les autres nouveaux analogues. Cependant, 3 semblait adopter une structure secondaire dans un mélange 1: 1 H2O: TFE (figure ​ (figure3) 3) le milieu qui était utilisé pour tous les spectres CD suivants. Le spectre, avec deux minima centrés à environ 1,99 et 220 nm, ressemblait à celui précédemment obtenu pour 2 TFE pur (résultats non publiés). Dans 1: 1 H2O: TFE, des spectres CD presque identiques pour les trois dérivés 2, 3 et 4 ont suggéré que la troncature n’affecte pas significativement la conformation dans ce milieu. De manière surprenante, la structure du 8-mer 5 non glycosylé semble être significativement plus organisée que la structure de 3 (Figure 2) (Figure 3) .3).D’autres résultats notables (voir figure ​ figure4) 4) montrent que (1) le composé 7 (10%) était significativement moins organisé que la structure 3, (2) les composés 8 (inactif) et 9 (activité complète) des spectres presque superposables, et (3) une substitution avec des acides aminés non naturels n’a pas conduit à des structures organisées (composés 11, 12 et 13; figure S1 dans les informations de support). Les spectres de la figure 3CD d’une solution M de 2 (ligne bleue), 3 (ligne rouge), 4 (ligne noire) et 5 (ligne verte) dans H2O: TFE (1: 1) enregistré à 25 ° C.Figure 4CD spectres de 50 &#x003bc M solutions de 3 (ligne rouge), 7 (ligne verte), 8 (ligne rose), 9 (ligne noire) et 10 (ligne bleue) dans H2O: mélange TFE (1: 1) enregistré à 25 &#x000b0 Les glycopeptides synthétisés dans cette étude ont également été examinés par spectroscopie RMN en solution aqueuse. Tous les peptides 8-mères du tableau S1 dans l’information de support ont été entièrement affectés par des expériences RMN exhaustives (une comparaison représentative des déplacements chimiques et des coefficients de température pour les composés 3 et 5 peut être trouvée dans le tableau S2 et la figure S3 dans les informations de support). Les spectres des dérivés de l’APF dans 9: 1 H2O: D2O, en général, donnaient des signaux bien dispersés et nets, suggérant peu ou pas d’échange chimique lent sur l’échelle de temps RMN. Des solutions tamponnées à pH 4,6 ont donné les spectres de qualité supérieure par rapport à plusieurs valeurs de pH testées. Un graphique empilé de la région amide de plusieurs analogues à 8 résidus synthétisés ici est montré sur la figure ​ La plupart des protons NH ont été complètement résolus dans plusieurs dérivés, suggérant des conformations préférées en solution. Quelques observations plus remarquables ont été (1) des valeurs de déplacement chimiques uniformes sur tous les dérivés pour les protons d’amide pour GalNAc, Val2, Ala4 et Ala5, indiquant, peu “ cross-talk ” entre les extrémités N et C; (2) des différences de déplacement chimiques très distinctes pour les deux protons du carboxamide C-terminal pour “ inactifs ” dérivé 6; et (3) une population plus élevée de la liaison cis-amide pour Pro3 lorsque le sucre est éliminé. De plus, les données du coefficient de température de l’amide ont montré que la valeur de T de Val2 a diminué de − 7,3 à − 6,0 ppb / K, indiquant un éventuel blindage ou H effet de liaison sur la glycosylation. Nos données jusqu’à présent (références (17) et (18) et résultats non publiés) ont montré qu’un profil distinct de disaccharide de sucre est important pour le maintien de l’activité. Les sucres ont des effets conformationnels importants et également lointains, qui peuvent à leur tour être étroitement liés aux changements de l’activité antiproliférative.Figure 5 Spectres RMN unidimensionnels de la région amide des dérivés 8-mère APF dans 9: 1 H2O: D2O dans un tampon acétate, pH 4,6. Les affectations d’acides aminés sont étiquetées sur les pics. Les étiquettes composées pour chaque spectre (droite du spectre) identifient la substitution employée … À l’exception des valeurs pour les résidus d’alanine, l’amide à trois liaisons-H α (3JNH – α) les constantes de couplage se sont révélées être comprises entre 7,0 et 8,8 Hz, indiquant une conformation étendue dans le squelette (les valeurs représentatives 3JNH – &#x003b1 pour les composés 3 et 5 sont listées dans les informations de support). Cependant, 3JNH – α les valeurs se situaient entre 4,8 et 6,0 Hz pour presque tous les résidus d’alanine, ce qui est cohérent avec les angles du squelette qui ressemblent à des motifs torsadés (hélicoïdaux). Il est intéressant de noter que des valeurs de 5,2 Ȣ 5,9 Hz ont été observées pour les résidus Ala4-Ala7 pour le dérivé de la trialanine 9 complètement actif, ce qui suggère une “ alanine étendue ” courte extension de la structure secondaire de type plié. En revanche, le 3JNH – α les valeurs pour Val6-Val8 dans les deux 2 et 3 étaient comprises entre 7,9 et 8,7 Hz. Une analyse plus poussée a montré que les indices de déplacement chimique26,27 pour le carbone du squelette, l’azote et H α les protons (données non montrées) ont suggéré que, contrairement à notre hypothèse originale, la queue C-terminale pourrait être plus étroitement structurée en un β -motif et non α -disposée. L’examen de ces données combinées nous amène à conclure qu’il y a peu de corrélation entre les observables RMN dans les résidus C-terminaux et l’activité.Le seul récepteur connu pour AS-APF est CKAP4, une protéine palmitoylée réversiblement de ∼ le reticulum endoplasmique aux microtubules20,28. Les études structurales sur CKAP4 ont rapporté que le grand domaine extracellulaire / luminale de cette protéine (supposé où APF se lie) est une spirale enroulée hélicoïdale qui forme de grands agrégats.29 Fait intéressant, la seule autre protéine isolée de solubilisée protéines membranaires de la membrane épithéliale de la vessie avec APF était la vimentine, une protéine de filament intermédiaire qui forme également des spirales enroulées hélicoïdales. Il est possible que l’as-APF perturbe les interactions protéine-protéine au cours de la multimérisation de CKAP4. En variante, l’APF pourrait fonctionner par rupture des interactions spirales CKAP4 / vimentine enroulées. Ces perturbations peuvent empêcher la signalisation ultérieure ou l’internalisation de la protéine chaperon CKAP4.Les variées “ conformations ” des analogues actifs de l’APF suggèrent également que l’APF peut agir sur plus d’un motif sur la surface de la protéine, une explication provisoire de l’activité de confusion oscille avec des changements mineurs au squelette peptidique. En résumé, notre composé principal, as-APF (2), a un profil SAR unique et distinct qui est maintenu dans les dérivés tronqués par Ala9. Dans la présente étude, nous avons identifié deux dérivés très puissants de AS-APF et déterminé que Ala6 − 8 analogue 9 est le “ le plus simple ” dérivé entièrement puissant de l’APF synthétisé à ce jour. Les données RMN commencent à découvrir des indices importants sur les implications structurelles des caractéristiques spécifiques de la molécule APF. Ces données aideront à concevoir des glycopeptidémimétiques qui pourraient être des outils utiles dans le traitement des IC / PBS et du cancer.