Utilité du génotypage répétitif en tandem à répétition intercalée mycobactérienne rapide à unités variées dans l’analyse mycobactériologique clinique

Contexte Analyse de nombres variables de répétitions en tandem VNTR d’éléments génétiques appelés unités répétitives mycobactériennes intercalées Les MIRUs sont une méthode PCR en chaîne par polymérase récemment décrite, utilisée pour génotyper Mycobacterium tuberculosis. Elle est beaucoup plus rapide, nécessite moins d’ADN et a environ le même pouvoir discriminant que la méthode RFLP de polymorphisme de longueur de fragment de restriction IS standard Nous rapportons l’adaptation et l’optimisation du génotypage MIRU-VNTR sur un système d’électrophorèse capillaire Nous décrivons son application aux situations cliniques typiques rencontrées dans notre laboratoire Institut Pasteur de Bruxelles, Laboratoire Tuberculose et Mycobactéries; Le génotypage MIRU-VNTR a été réalisé sur des cultures de M tuberculosis inactivées par la chaleur obtenues à partir de prélèvements cliniques sur milieu solide de Löwenstein ou sur tubes mycobactériens indicateurs de croissance Becton Dickinson Après amplification de loci génomiques par PCR multiplex, les fragments d’ADN ont été séparés par électrophorèse capillaire Utilisation de l’ABI Prism -Avant Genetic Applied Applied Biosystems Le dimensionnement des fragments PCR et l’attribution des différents allèles MIRU-VNTR ont été réalisés à l’aide du logiciel GeneScan et des progiciels Genotyper personnalisés PE ​​Applied BiosystemResults Clustering sur la base des empreintes digitales IS des isolats de différents patients le même hôpital a été confirmé par typage MIRU-VNTR Cette concordance entre des techniques indépendantes, hautement discriminatoires, a été déterminante dans le déclenchement d’une enquête épidémiologique qui a permis d’identifier une infection nosocomiale par tuberculose liée à la bronchoscopie traumatique. Enfin, l’analyse automatisée MIRU-VNTR a permis d’identifier en quelques heures la contamination de laboratoire dans des cultures liquides de M tuberculosis. Conclusion Ces exemples illustrent l’utilité de cette méthode. technique de génotypage pour une résolution rapide et précise des problèmes couramment rencontrés en mycobactériologie clinique

La détection rapide, la thérapie adéquate et le dépistage des contacts pour arrêter la transmission sont des facteurs clés dans le contrôle de la maladie. Les méthodes de génotypage de Mycobacterium tuberculosis permettent d’identifier la voie de transmission de la maladie, différencier la réinfection de la réactivation, et détection de contamination de laboratoire Les méthodes de génotypage les plus fréquemment utilisées pour M tuberculosis sont le polymorphisme de longueur de fragment de restriction RFLP qui cible l’élément transposable IS et l’analyse RFLP de spoligotypage utilisant IS comme sonde est la méthode standard , avec puissance et grande base de données de modèles disponibles Néanmoins, cela prend du temps, est exigeant sur le plan technique et difficile à normaliser entre les laboratoires Spoligotypage cible des séquences d’espacement entre des éléments répétitifs dans le locus dit “direct repeat” par PCR et point inverse -blot analysis C’est plus facile, pas cher er, et plus rapide mais a moins de pouvoir discriminant que l’analyse RFLP IS Une autre technique basée sur la PCR a récemment été décrite qui cible les locus contenant des répétitions en tandem à nombre variable VNTRs d’éléments génétiques nommés MIRUs interchangeables mycobactériennes régions intergéniques intercalées dans le génome de M tuberculosis [, -] Cette méthode a été démontrée applicable à des études de génotypage et d’épidémiologie moléculaire très fiables de M tuberculosis [,,,, -] Elle a montré un pouvoir discriminant proche de celui de RFLP analyse dans plusieurs études [,, -] Comparé avec l’analyse RFLP IS, le génotypage avec MIRU-VNTR a l’avantage d’être plus rapide et applicable aux extraits d’ADN bruts, ainsi que de permettre une comparaison facile et rapide des résultats de laboratoires indépendants. technique par l’utilisation des séquenceurs à base de gel ABI Applied Biosystems ou des séquenceurs automatiques à base de capillaires Beckman Beckman-Coulter Applied Biosystems Nous décrivons son application aux situations cliniques typiques rencontrées dans notre laboratoire Institut Pasteur de Bruxelles, Laboratoire Tuberculose et Mycobactéries; Bruxelles, Belgique, y compris la confirmation d’une infection nosocomiale liée à la bronchoscopie associée à la tuberculose; détection d’une infection tuberculeuse mixte; et identification de la contamination en laboratoire dans les cultures positives pour le complexe M tuberculosis Ces exemples illustrent l’utilité de cette technique pour obtenir une interprétation concluante beaucoup plus rapide dans l’analyse clinique mycobactériologique quotidienne

Matériaux et méthodes

Matériau clinique Le génotypage MIRU-VNTR a été réalisé sur des cultures de M tuberculosis inactivées thermiquement obtenues à partir de prélèvements cliniques sur milieu solide Löwenstein ou dans des tubes liquides indicateurs de croissance de mycobactéries MGIT après incubation dans le système Bactec MGIT Becton Dickinson Les cultures solides ont été suspendues dans de l’eau stérile et inactivées par chaleur min à ° C Les cultures liquides ont d’abord été centrifugées en ml et suspendues dans: Tris-EDTA mM avant inactivation par chaleur min à ° C. L’identification des cultures mycobactériennes inactivées positives a été réalisée par amplification PCR de l’élément IS, spécifique Les méthodes de génotypage MIRU-VNTR ont été amplifiées à partir de loci génomiques en utilisant différentes PCR multiplex avec les amorces fluorescentes précédemment décrites, sauf que le marquage Hex a été remplacé par le marquage Vic . HotStartTaq polymérase Qiagen utilisant les mêmes conditions de cyclage que dans , e Les fragments d’ADN ont été séparés par électrophorèse capillaire en utilisant les paramètres d’analyse ABI Prism – Avant Genetic Analyzer Applied Biosystems. créé à partir du module par défaut de GeneScan POP, avec une tension de fonctionnement changée de kV à kV et le meilleur temps d’exécution défini s Le dimensionnement des fragments de PCR et l’attribution des différents allèles MIRU-VNTR ont été effectués à l’aide du logiciel GeneScan. Applied Biosystem, comme dans et sur la base des conventions décrites dans Les tableaux utilisés pour la notation allèle MIRU-VNTR sont disponibles sur http: // wwwiblfr / mirus / mirushtml Les résultats sont exprimés sous la forme d’un code numérique représentant le nombre de MIRU-VNTRs dans chacun des loci génomiques IS L’analyse RFLP a été réalisée conformément aux directives internationalement reconnues , et les résultats ont été analysés avec BioNumerics Applied Mathématiques utilisant le coefficient de dés et la méthode de groupe de paires non pondérée avec des moyennes arithmétiques

Résultats

Adaptation à l’analyseur d’ADN multicapillaire Le présent ensemble de locus M tuberculosis contient des MIRU-VNTR avec des tailles unitaires récurrentes allant de à bp Classiquement, le nombre d’unités variables dans chaque locus est calculé en mesurant la taille des fragments amplifiés avec des amorces spécifiques. s’hybridant aux régions flanquantes MIRU-VNTR, qui reflète le nombre de copies VNTR amplifiées Un système a été décrit qui implique l’analyse de dimensionnement de différents dosages PCR multiplex de loci chacun sur un séquenceur automatique ABI à base de gel Ce système a été adapté et testé pour l’utilisation sur le système d’électrophorèse capillaire ABI Prism -Avant, comme suit: Les paramètres d’électrophorèse ainsi que les déterminations de taille et les allèles précis ont été déterminés en analysant des fragments PCR amplifiés de M tuberculosis HRv et d’autres isolats, pour lequel le statut allélique était connu à partir d’une analyse de séquence et / ou d’une analyse sur un séquenceur ABI. De ce fait, des tolérances de taille de ± bp Ces corrections corrigent les différences de migration relative entre la taille standard et les amplicons sur le polymère utilisé pour l’électrophorèse.

Table View largeDownload slideOffsets pour chaque locus, en fonction du nombre de répétitions en tandem d’unités répétitives intercalées mycobactériennes MIRUsTable View largeDownload slideOffsets pour chaque locus, en fonction du nombre de répétitions en tandem d’unités répétitives intercalées mycobactériennes MIRUsPour tester la reproductibilité de la technique, chacun de les loci de souches ont été analysés fois Le dimensionnement a été trouvé hautement reproductible dans la plage de travail de – bp, avec des précisions moyennes à l’intérieur et entre les séries de ± et ± bp, respectivement, donc des tolérances de taille de ± bp l’identification non ambiguë des allèles MIRU-VNTR, dont la taille diffère de – bp En partie grâce à la sensibilité accrue du système versus, le nombre de cycles pendant l’amplification PCR pourrait être réduit par rapport aux conditions précédentes , qui élimination autorisée de toutes les étapes de dilution du produit de PCR avant le chargement Dans ces conditions, la durée du génotypage le processus, y compris la PCR, est de seulement h par isolat, à partir d’extrait d’ADN brut obtenu à partir de culots cellulaires de cultures MGIT positives pour M tuberculosis. La procédure ci-dessus a ensuite été appliquée à des isolats d’intérêt Les schémas de MIRU-VNTR et IS

Figure Vue largeDownload slideRésultats d’analyse génotypique pour des situations cliniques étudiés à l’Institut Pasteur de Bruxelles, Laboratoire Tuberculose et Mycobactéries Bruxelles, Belgique Gauche, typage des résultats de nombres variables de répétitions en tandem VNTR d’unités répétitives intercalées mycobactériennes MIRU pour tous les cas, exprimés en codes numériques correspondants au nombre de MIRU dans chacun des locus Les nombres en gras représentent les allèles qui diffèrent entre les souches Droites, polymorphismes de longueur de fragment de restriction IS pour les cas et les flèches, bandes en commun entre les motifs RFLPFigure Voir grandDownload slideRésultats de l’analyse de génotype pour les situations cliniques étudiées à l’Institut Pasteur de Bruxelles, Laboratoire Tuberculose et Mycobactéries Bruxelles, Belgique Gauche, typage des résultats des nombres variables de répétitions en tandem VNTR des unités répétitives mycobactériennes intercalées MIRU pour tous les cas, exprimés en codes numériques correspondant au nombre de MIRU dans chaque o Les locus Les nombres en gras représentent les allèles qui diffèrent entre les souches Droites, polymorphismes de longueur de fragment de restriction IS, modèles RFLP pour les cas et flèches, bandes communes entre les profils RFLPSituation: identification de l’infection nosocomiale associée à la bronchoscopie de différents patients qui ont fréquenté le même hôpital pendant une période ont été analysés rétrospectivement par RFLP d’IS, et chacun a montré un modèle multibandes identique, suggérant l’infection nosocomiale parce qu’il y avait des doutes sérieux parmi les pneumologues au sujet de la possibilité que les patients ont été infectés avec la même Une analyse MIRU-VNTR a été réalisée pour évaluer cette question. Des génotypes complètement identiques ont été obtenus, confirmant pleinement la clonalité des isolats. Grâce à cette confirmation avec un ensemble indépendant de marqueurs de génotypage hautement discriminatoires, une enquête épidémiologique approfondie a été menée dans cet hôpital. conduit t o la constatation que ces patients indépendants ont eu, le même jour, le même service de chirurgie pneumologique pour examen bronchoscopique. Le patient G a présenté des preuves radiologiques et cliniques de tuberculose active au moment de l’examen bronchoscopique. Sa TB-MR, provoquée par un échec thérapeutique, était bactériologiquement confirmée plusieurs jours plus tard par une culture positive pour M tuberculosis obtenue à partir d’un frottis positif. Un examen bronchoscopique a été entrepris pour confirmer le diagnostic de sarcoïdose. Ce patient était négatif pour les bacilles acido-résistants, mais était positif à la culture pour M tuberculosis, bien que Six semaines plus tard, l’infection du patient H a été confirmée par une nouvelle culture d’un échantillon d’expectoration induite qui a été identifié comme positif pour M tuberculosis, avec le même RFLP et Modèles MIRU-VNTR comme premier isolat Ce résultat suggère que le patient L’exposition au bronchoscope contaminé a provoqué une infection subclinique, bien que l’on ignore encore comment le patient a développé une infection détectable en si peu de temps en l’absence d’immunodéficience profonde. Le patient I avait initialement une culture qui ne aucun signe ou symptôme compatible avec la tuberculose La maladie a été détectée seulement un an plus tard, quand une culture d’échantillon d’expectoration à bacilloscopie négative, obtenue lorsque le patient a été hospitalisé en raison de symptômes cliniques de tuberculose, s’est révélée positive pour la tuberculose.

Tableau View largeTélécharger slideHistoire de patients infectés par la même souche de Mycobacterium tuberculosis multirésistanteTable View largeTélécharger DiapositiveHistoire de patients infectés par la même souche multirésistante de Mycobacterium tuberculosisSituation: détection d’une infection tuberculeuse mixte Cultures d’échantillons cliniques prélevés sur un patient et sa fille L’isolat du père était résistant à l’isoniazide et l’isolat de la fille était sensible à tous les médicaments antituberculeux de première intention. Le profil RFLP de l’isolat du père était multiple et était difficile à interpréter en raison de la présence d’un mélange. de bandes fortes et faibles Certaines de ces bandes étaient partagées par l’isolat de la fille, ce qui soulève la possibilité d’une population de souches mixtes dans la culture du père. L’analyse de MIRU-VNTR a révélé la présence simultanée de différents allèles dans les locus de cet isolat. obtenu pour d’autres spéci mens collectés par le père à différents moments au cours d’une période de temps Cette observation a confirmé le soupçon que le père était infecté par différentes souches de M tuberculosis. De plus, des allèles dans les locus décrits ci-dessus correspondaient systématiquement à l’allèle unique détecté dans les mêmes locus de Cette observation indiquait clairement que les souches de la culture du père étaient responsables de l’infection de la fille. Les schémas de sensibilité aux médicaments décrits ci-dessus indiquent que cette souche était sensible à l’isoniazide, au moins chez les enfants. l’heure de la transmission

Figure View largeTéléchargement de diapositivesGenotyper profils, obtenus avec l’utilisation de logiciels Genotyper personnalisés PE ​​Applied Biosystem montrant différents allèles dans loci MIRU, unité répétitive mycobactérienne disperséeFigure Voir grandTélécharger une diapositiveGenotyper profils, obtenus avec l’utilisation de logiciels Genotyper personnalisés PE ​​Applied Biosystem montrant différents allèles dans loci MIRU , unité mycobactérienne intercalée répétitiveSituation: identification de la contamination croisée en laboratoire Les cultures positives de MGIT provenant d’échantillons prélevés chez différents patients et décontaminées avec du N-acétyl-L-cystéine-NaOH le même jour dans le même laboratoire ont toutes été identifiées comme M tuberculosis par PCR. une telle simultanéité des cultures positives pour M tuberculosis dans un seul laboratoire est peu probable dans un pays à faible incidence comme la Belgique, nous avons décidé de génotyper les isolats Les cultures, déjà granulées et inactivées pour l’identification PCR, ont été directement analysées par MIR Génotypage U-VNTR Les résultats ont été obtenus plusieurs heures plus tard Quatre patients A, B, D et F avaient des isolats avec exactement le même génotype MIRU-VNTR, ce qui suggère un éventuel cas de contamination croisée en laboratoire. L’analyse des données cliniques a confirmé par la suite que seuls les patients B, C et E étaient atteints de tuberculose. , D et F, qui étaient tous négatifs au frottis, étaient positifs à la culture à la suite d’une contamination par l’échantillon à frottis positif obtenu du patient B Cette contamination s’est probablement produite pendant la procédure de décontamination et d’homogénéisation

Discussion

Les infections, en particulier lorsque le bronchoscope est insuffisamment désinfecté entre les patients Une détection appropriée et incontestable de ces infections liées à la bronchoscopie est importante pour la réévaluation ultérieure des procédures de contrôle de l’infection Dans notre exemple, il y avait encore un sérieux scepticisme chez les pneumologues. la survenue d’un tel événement potentiel de transmission de la tuberculose nosocomiale, malgré l’évidence initiale fournie par l’analyse RFLP MIRU-VNTR et l’analyse RFLP IS, repose sur des marqueurs génomiques indépendants et, globalement, ont montré approximativement le même pouvoir discriminant dans différentes situations. Par conséquent, la concordance entre les résultats de l’analyse MIRU-VNTR et IS RFLP a été déterminante dans le déclenchement d’une enquête épidémiologique, confirmant par la suite l’infection MDR-TB suspectée liée à la bronchoscopie chez les patients impliqués. génotype de ces isolats, une infection nosocomiale possible chez ces patients Si cela avait été le cas auparavant, une analyse RFLP IS aurait néanmoins été réalisée ultérieurement pour confirmation en raison du fort scepticisme des pneumologues qui n’étaient déjà pas convaincus par les résultats du RFLP en première instance. une culture peut être causée par une infection mixte chez un patient ou une contamination croisée en laboratoire pendant le traitement La présence de populations de souches mixtes peut sérieusement perturber l’interprétation ultérieure des connexions épidémiologiques entre les patients impliqués, ainsi que l’interprétation de Par conséquent, la détection facilitée de tels événements peut être bénéfique à la fois pour les niveaux individuels de contrôle des patients et de contrôle épidémiologique. La présence de souches mixtes peut être difficile à déterminer dans une analyse initiale RFLP IS, car les souches mixtes peuvent résultat dans un modèle d’empreintes digitales complexes, comme dans la figure Détection de ins par spoligotypage est également difficile, voire impossible, avec l’utilisation de l’isolat initial uniquement, et nécessite une analyse plus poussée des colonies isolées Une de nos études montre que la présence de souches dans la même culture peut être détectée plus facilement et sans ambiguïté par l’observation concordante des allèles dans plusieurs loci MIRU-VNTR indépendants La présence simultanée d’allèles dans plusieurs locus exclut la possibilité d’émergence sporadique d’un variant allélique donné dans un isolat clonal. Ces patrons avec allèles étaient clairement distincts du soi-disant “pic de stutter” modèles observés avec certains locus MIRU-VNTR Il est à noter que les mêmes résultats ont été obtenus à partir d’autres échantillons prélevés à différents moments chez un même patient, ce qui exclut la possibilité de contamination croisée en laboratoire ou de problèmes triviaux de contamination de l’ADN. , dans une telle situation, les résultats de MIRU-VNTR seuls peuvent être pris comme preuve pour une infection mixte Cependant, il sh Bien que cette méthode soit basée sur la PCR, un mélange avec de faibles proportions d’une souche donnée restera probablement indétectable. La détection précoce de cultures faussement positives de M tuberculose provoquées par une contamination croisée en laboratoire peut éviter de graves effets indésirables sur la prise en charge [, ,] IS RFLP analyse, qui nécessite un total de ⩾ semaines pour comparer les souches après l’inoculation de culture , ne peut être utilisé à cette fin L’analyse VNTR manuelle sur la base de locus et en utilisant l’électrophorèse sur gel d’agarose ou spoligotypage a été montré utile la détection rapide et pratique de tels événements de contamination L’application du typage VNTR avec des PCR multiplexes et un séquenceur capillaire augmente encore la rapidité de détection. Le processus de génotypage lui-même ne prend que h par PCR, ce qui n’est pas plus long que Identification PCR des cultures Nous appliquons régulièrement ce procédé sur des extraits bruts d’ADN de pastilles mycobactériennes tuées à la chaleur de Les cultures de MGIT peu après qu’elles deviennent positives Selon la charge bactérienne initiale, la durée totale nécessaire pour obtenir les génotypes, à partir de l’obtention de l’échantillon clinique, peut être réduite à quelques jours. De plus, comme indiqué ci-dessus, l’utilisation de MIRU- Les locus VNTR permettent, dans de nombreuses situations, un pouvoir discriminant proche de celui de RFLP IS contrairement au spoligotypage ou au VNTR sur la base des locus Une certaine spécificité supplémentaire peut même être obtenue par l’utilisation du spoligotypage en conjonction ou, est probable, par l’inclusion de certains locus VNTR supplémentaires [, ,, -] Ce pouvoir discriminatoire accru sera utile pour fournir une spécificité plus élevée dans la détection des événements de contamination, en particulier dans les milieux où certaines souches génétiquement apparentées, mais pas identiques, prédominent. notre étude montre que la technique automatisée MIRU-VNTR, qui est un outil puissant pour des études épidémiologiques moléculaires à grande échelle, est également utile dans les mycobactéries cliniques de routine analyse logique

Remerciements

Nous remercions Polydor Sonck, pour son assistance technique dans l’analyse RFLP de l’IS, et Cristina Gutierrez Institut Pasteur de Bruxelles, pour la lecture critique du manuscrit. Soutien financier Institut Scientifique de Santé Publique, département Institut Pasteur, Belgique; Région de Bruxelles-Capitale: Institut National de la Santé et de la Recherche Médicale, Institut Pasteur de Lille et Région Nord Pas-de-Calais, France CA; Centre National de la Recherche Scientifique PSConflit d’intérêt Tous les auteurs: Pas de conflit